Type II restriction and modification enzymes are an ideal model system for studying specific DNA-protein interaction because of their small size, simple catalytic requirements for activity, and sequence specificity.
We chose to study the interaction of the Type II endonuclease and its corresponding methylase from $\underline{Agrobacterium}$ $\underline{tumefaciens}$ SSI with DNA. The specific methylase for the recognition site of AtuS I endonuclease from $\underline{Agrobacterium}$ $\underline{tumefaciens}$ SSI was purified and its molecular and catalytic properties were studied. For the purification of the enzyme, 20 g of cells were used and disrupted by French press at 20,000 p.s.i.. After ammonium sulfate fractionation, the enzyme was further purified by phohphocellulose column chromatography and DEAE-cellulose column chromatography. The methylase has shown to have the site-specific methylation activity on the AtuS I recognition sequence
$'-CC^\mathbf{A}_\mathbf{T}GG-3'$.
And AtuS I methylase prefers double-stranded DNA than singlestranded DNA as a substrate. The enzyme showed maximum activity at values between 7.0 and 8.0 at $37^\circ{C}$. and does not essentially require NaCl, $Mg^{2+}$. AtuS I methylation did not inhibit subsequent restriction activities of BstN I and Zan I endonucleases.
Type II 제한효소 및 변형효소는 크기가 작고, 안정하며, 효소의 활성도를 위해서 요구하는 것이 간단하고, DNA 이중나선상에서 염기서열을 특이하게 인식하는 성질을 보이고 있어서, 분자생물학에 있어서 해명해야 할 과제의 하나인 DNA와 단백질간의 상호작용을 연구하는데 이상적인 모델 시스템이 되고있다. 한편 Type II 제한효소및 변형효소는 DNA 상에서 특이한 염기서열 인식능력 때문에, 제조합 DNA 연구에 유용하게 이용되고 있으며, 최근에는 특히 변형효소가 eukaryote 의 유전자발현연구에 이용되고 있다.
본 실험에서는 Type II 제한효소에 대한 연구의 하나로 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens SSl 으로부터 AtuS I 제한효소가 인식하는 염기서열에 특이한 변형효소를 정제하여 이 효소의 촉매적 특성이 연구되었다. 새로운 AtuS I 변형효소는 20 g 의 Agrobacterium tumefaciens SSl 으로부터 streptomycin sulfate 침전, ammonium sulfate 분획침전, phosphocellulose column chromatography, DEAE-cellulose column chromatography를 하여 최종적으로 total activity 4660 units 의 효소를 분리하였다.
이렇게 분리된 AtuS I 변형효소는 DNA 상에서 AtuS I 염기서열 즉 $'-CC^\mathbf{A}_\mathbf{T}GG-3'$을 특이하게 메틸화시킨다는 것이 밝혀져, AtuS I 제한효소와 AtuS I 변형효소가 DNA 상에서 동일한 염기서열을 인식함을 알 수 있었다. 자연상태의 salmon testes DNA 와 열변성된 salmon testes DNA 를 사용하여 AtuS I 변형효소의 작용속도가 비교되었는데, 열변성된 salmon testes DNA 의 경우에 그 정도가 자연상태의 DNA 에 비해 21% 밖에 되지않음이 조사되었다. 이러한 사실로부터 AtuS I 변형효소는 기질로서 이중나선의 DNA 를 더욱 좋아함을 알 수 있었다.
AtuS I 변형효소는 $37^\circ{C}$, pH 7.0 -8.0 에서 최대의 활성도를 보였다. NaCl, $Mg^{++}$, EDTA, sulfhydryl 화합물들은 AtuS I 변형효소의 활성에 별 영향을 미치지 않지만, 10 mM NaCl, 15 mM 2-mercaptoethanol 존재 하에서 최대의 활성도를 나타냈다.
다른 제한효소에 대한 AtuS I 변형효소의 작용효과를 보기위하여 BstN I, Zan I 제한효소를 사용하였고, 이들 제한효소는 AtuS I 제한효소와 DNA 상에서 같은 염기서열을 인식한다. 자연상태의 pUB110 DNA를 AtuS I 변형효소로 변형시킨 후에 BstN I, Zan I 제한효소를 각각 따로 처리하였을 때, AtuS I 변형효소는 BstN I 및 Zan I 제한효소의 작용을 저해하지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
