This research examines how and in what sense the development of multiplex detec-tion platform of genitourinary infectious pathogens based on mass spectrometry is poten-tially advantageous in terms of diagnosis. Within the process of examination, multiplex PCR, nicking reaction, and matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis were applied to enhance the detection efficiency through multiplex system. A condition for multiplex PCR method was settled in order to amplify all 13 types of genes from selected pathogens and $\beta$ -globin house-keeping gene. The multiplex PCR in this strategy enabled detection of samples of not only single infection but also multiple infections, which is very common case in infected patients. In order to ap-ply MALDI-TOF MS analysis to amplified PCR products, nicking reaction method was established in order to generate short DNA fragments that are used as mass markers. The mass markers used in this strategy are designed to be target-specific in order to enable the analysis of mass spectrometry to be performed in a multiplex manner as well. With this de-tection strategy, both single- and multiple-infected clinical human samples of 13 target pathogens were successfully diagnosed. The results show that this novel detection strategy applying mass spectrometry has a potential to be a convenient tool for diagnosis of Sexually Transmitted Diseases (STDs).
비뇨생식기 감염성 질환은 전 세계적으로 많은 인류가 고통을 받고 있는 세균 감영성 질환으롸, 신속한 치료를 위해서 빠르고 정확한 진단 시스템의 개발을 요구하고 있다. 이에 따라, 하루가 넘게 걸리는 기존의 세포 배양 검사보다는, DNA 와 같은 분자를 통해 진단하는 기술에 대한 연구들이 많이 진행되고 있다.
기존의 연구들은 multiplex PCR (polymerase chain reaction)을 이용해서 형광 분석을 응용하는 방법에 집중하고 있다. 그러나 민감도나 효율성이 떨어진다는 단점으로 인해 기존의 형광 분석 기술은 한계가 있다고 평가되고 있으며, 보다 더 효율적인 기술을 개발하기 위해 다양한 방식의 대체 연구가 진행되고 있다. 가령, 본 연구가 참고한고 있는 질량 붕석 기술은 기존 기술의 문제점을 극복함과 동시에 다중 감염성 질환의 원인균을 검출하는 데에 기여하고 있다. 따라서, 본 연구는 질량 분석 기술을 다중 감염성 질환 원인균에 적용 가능하도록 하는 질량분석 기반의 진단 플랫폼을 개발하고자 한다.
본 연구에 이용한 질량 분석기는 단잭질이나 핵산을 분석할 때 많이 사용되는 matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) 질량 분석기 (mass spectrometry, MS)이다. 단백질이나 핵산과 같은 생체 분자들은 레이저를 쏘아 줄 때 레이저에 의해 분해되거나 변성 될 가능성이 크기 때문에 직접적으로 레이저를 쏘아주기 어렵다는 한계점이 있다. 이를 극복하기 위해, MALDI-TOF MS 에서는 고분자 물지을 matrix 로 사용해서 레이저가 이 matrix 를 쏘고 간접적으로 생체 분자 시료를 이온화 시켜서 생체 분자 시료가 레이저에 의해 분해되는 것을 방지하였다.
이를 통해 개발된 플랫폼은 다음과 같다. 먼저 감염이 추정되는 환자에게서 채취한 샘플에서 DNA 를 추출하고 그 DNA 를 Polymerase chain Re-action (PCR)이라는 과정을 통해서 증폭한다. PCR 과정에서 필요로 하는 짧은 핵산 가닥인 primer 에 절단효소 인식부위 (nicking enzyme recofnition site)와 mass marker 의 상보적인 부분을 추가로 달아주면 이 부위들이 증폭과정에서 추출된 DNA 에 쉽게 결합한다. 그렇게 생선된 PCR 산물에 절단 효소 (nicking enzyme)를 넣어주면 절단효소 인식부위에서 반응을 일으키면서 DNA 를 절단하여 짧은 길이의 mass marker DNA 를 생산한다. 이 mass marker 는 표적 감염균마다 길이나 염기 졸류를 다르게 하여 분자 질량이 구분 되도록 조절 할 수 있다. 따라서 절단 효소 반응까지 완료 한 후 얻는 mass marker 를 MALDI-TOF MA 로 분석하여서 특정 표적 감염균의 mass marker 위치에서 mass peak 가 보이는 지를 확인함으로써 감염성 질환 원인 균의 존재 유무를 알 수 있다.
연구의 표적으로는 비뇨생식기 감염균 중 성 감염성 질환의 원인 균(sexually transmitted diseases, STD) 13 종의 DNA 를 선정하였으며, 대조실험을 위해서 대표적인 human internal control로 사용되는 $\beta$ -globin 을 이용하였다. 또한, 플랫폼의 실현가능성을 확인하기 위해 대장균 세포에서 추출된 plasmid DNA 를 표준시료로 이용하여 single PCR 과 multiplex PCR 모두 실험하였고 MALDI-TOF MS 를 이용해서 mass peak 가 제대로 뜨는지 확인하였다. 그 결과, 해당하는 시료가 존재할 경우만 PCR 과 절단효소반응이 진행되어 시료에 맞는 mass peak 가 뜨는 것을 확인하였다. 이와 동시에, 플랫폼이 실제 임상 진단에 사용될 수 있는지 역시 확인하기 위하ㅏ여 임상시료를 이용한 실험을 진행하였다. 그 결과 감염된 환자에게서 얻은 임상 시료에서만 원인균의 종류에 해당하는 mass peak 와 $\beta$ -globin 의 mass peak 가 뜨는 것을 확인할 수 있었고, 비감염환자의 시료에서는 $\beta$ -globin 의 mass peak 만 뜨는 것을 확인할 수 있었다.
임상 샘플을 이용한 실험을 통해, 본 연구에서 개발된 플랫폼이 실제 STD 에 감염됨 환자들을 진단할 수 있는 기술로 발전될 충분한 가능성을 가진 것을 확인하였다. 이 플랫폼은 한국인들이 주로 감염되는 STD 원인 균 13 종을 표적으로 하고 있지만, primer 의 표적을 지정하는 방식에 따라 다른 STD 원인균을 표적으로 할 수도 있고 심지어 STD 가 아닌 다른 질환의 원인 균을 표적으로 할 수도 있다. 이는 본 플랫폼이 정확도, 민감도, 시각 단축 등의 직접적인 장점뿐만 아니라 여러 분야에 적용 가능한 기술적 유연성을 기지고 있는 "플랫폼" 이라는 사실을 증명한다.
