Bone abnormalities, one of the primary manifestations of Menkes disease (MD), include a weakened bone matrix and low mineral density. However, the molecular and cellular mechanisms underlying these bone defects are poorly understood. Here, we present in vitro modeling for impaired osteogenesis in MD using human induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a mutated ATP7A gene. MD-iPSC lines were generated from two patients harboring different mutations. The MD-iPSCs showed a remarkable retardation in CD105 expression with morphological anomalies during development to mesenchymal stem cells (MSCs) compared with wild type (WT)-iPSCs. Although prolonged culture enhanced CD105 expression, interestingly, mature MD-MSCs presented with low alkaline phosphatase activity, reduced calcium deposition in the extracellular matrix, and down-regulated osteoblast-specific genes during osteoblastic differentiation in vitro. Copper chelation in WT-MSCs recapitulated the aberrant phenotypes observed in MD-MSCs, but copper treatment in MD-MSCs did not rescue the impaired osteogenesis. Lysyl oxidase activity was also decreased in MD-MSCs during osteoblastic differentiation. Our findings indicate that ATP7A dysfunction contributes to retardation in MSC development and impairs osteogenesis.
멘케스병은 세포내의 주요 구리전달자인 ATP7A의 결손으로 생기는 질병이다. ATP7A는 일차적으로 구리의 흡수에 관여하며 세포내의 구리를 분배시키는 역할을 한다. 구리는 정상적인 발달을 위해 필수적인 전이원소로써 그 양은 매우 엄격하게 조절되어야 한다. ATP7A의 결손으로 생기는 멘케스병은 세포내의 구리부족을 야기하게 되는데 이는 구리를 필요로 하는 다양한 효소들의 활성감소로 이어진다. 멘케스병에서 주로 나타나는 증상은 심각한 신경퇴화, 정신지체, 결합조직이상, 부서지는 머리, 저색소 침착 등이 있다. 그 중에서 결합조직 이상은 가장 대표적인 증상이며, 혈관이상, 골격변화, 피부탄력저하, 관절이상 등을 동반한다. 하지만 위와 같은 증상의 정확한 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 없으며 연구에 적합한 세포모델도 부재인 상황이다.
따라서 본 연구에서는 결합조직에서 보이는 멘케스병의 병리생리학적 메커니즘 분석 연구에 초점을 맞추었고, 그를 위해 역분화 줄기세포 모델을 이용하였다. 역분화 줄기세포는 체세포에서 유래된 세포로 배아줄기세포와 같이 다능성과 자가재생능력을 가진 세포로 질병의 메커니즘 연구에 강점을 보이는 세포유형이다. 역분화 기술을 적용하여 두 멘케스병 환자로부터 멘케스병 특이적 역분화 줄기세포 주를 확립하였고, 결합조직 이상의 연구를 위해 중간엽 줄기세포로의 분화실험을 수행하였다.
그 결과로 멘케스병 특이적 역분화 줄기세포에서 중간엽줄기세포로의 분화과정이 지연됨을 확인하였다. 정상 역분화 줄기세포와는 달리 멘케스병 특이적 역분화 줄기세포의 경우 형태적인 변화가 늦게 일어나고 중간엽 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 표지마커가 낮은 수준임이 판명되었다. 비록 정상 역분화 줄기세포에 비해 늦은 발달을 보였지만, 오랜 시간의 배양을 통해 멘케스병 특이적 중간엽 줄기세포를 성공적으로 유도하였는데, 세포 성장, 생존능, 세포사멸비율, 그리고 세포주기면에서 차이를 보이지 않는 다는 것을 확인 할 수 있었다. 즉, ATP7A의 결손이 분화과정을 지연시키지만 확립된 중간엽 줄기세포의 기본적인 기능에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
다음으로는 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화를 통해 골형성이상의 표현형을 재현하고 분석하는 연구를 수행하였다. 멘케스병 특이적 중간엽줄기세포의 골세포 분화과정동안 특이적으로 발현하는 유전자인 ALP가 낮은 수준으로 발현하고 있었고, 골세포의 세포외 기질의 칼슘을 염색해 보았을 때도 정상 중간엽 줄기세포에 비해 적은 양이 축적되었음을 알 수 있었다. 뼈를 이루는 골세포의 경우 칼슘을 비롯한 다양한 미네랄이 결정을 형성하여 세포외 기질에 축적이 되어야만 하는데, 멘케스병 중간엽 줄기세포의 경우는 그 과정에 결함이 있음을 확인할 수 있었다.
또한 골형성 과정에서 구리의 역할을 알아보기 위해 구리의 농도를 낮추는 약물인 BCS를 정상 중간엽 줄기세포에 처리해 보았더니, 멘케스병 중간엽 줄기세포에서 보이는 증상과 비슷한 현상이 그대로 재현됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 멘케스병에서 나타나는 골형성 이상이 구리를 사용하지 못함으로 일어나는 결과임을 암시한다. 추가적으로 멘케스병의 골세포 분화 과정에서 다량의 구리를 처리해 보았으나 증상을 완화시키지는 못 한다는 사실도 확인하였다.
종합적으로 본 연구는 역분화 줄기세포를 이용한 멘케스병의 세포모델연구로서 멘케스병에서 나타나는 증상들을 재현하고 분석하는데 목적을 두고 있다. 특히, 멘케스 병에서 보여지는 중간엽 줄기세포의 발달 지연은 역분화 줄기세포를 이용하지 않고서는 알아 낼 수 없는 증상이며 기존의 멘케스병 연구에 새로운 시각을 제시해 주었다. 또한 골세포의 분화를 통해 세포수준에서 일어나는 골형성의 결함을 확인할 수 있게 해주었는데, 이는 본 연구에서 유도한 멘케스병 역분화 줄기세포가 질병의 세포모델로써 가치가 있다는 것을 말해준다. 앞으로 이와 같은 연구가 멘케스병 뿐만 아니라 다른 다양한 질병으로 까지 확대된다면 세포 수준의 메커니즘 분석뿐만 아니라 치료 목적을 위한 약물 또는 세포치료제 개발 등에 적용될 수 있을 것이며 막대한 산업적 가치가 있을 것이라 판단된다.
