RNA polymerase III is one of eukaryotic polymerases and transcribes tRNA, 5S rRNA, and many other noncoding RNAs. Generally, to recruit RNA polymerase III into promoters of the noncoding RNA genes, various transcription factors including TFIIIC and TFIIIB were needed. Especially, TFIIIB is a target regulator affected by some oncogenes or tumor suppressor genes. Therefore, non-coding RNAs transcribed by RNA polymerase III can be overexpressed in tumor cells. Brain cytoplasmic 200 RNA (BC200 RNA), which was first identified as a noncoding RNA in neuronal cells, transcribed by RNA polymerase III. Since BC200 RNA was not observed in somatic cells other than neurons, it was regarded as a neural-specific RNA. Howev-er, BC200 RNA is also highly expressed in a number of tumors that are of non-neuronal origin. Therefore, it is conceivable that there exists a regulatory circuit for BC200 RNA expression in tumor cells. Since promoter elements for BC200 RNA transcription have not been identified yet, in this thesis, the promoter elements re-quired for efficient expression of BC200 RNA were analyzed in HeLa cervical carcinoma cells. Mutagenesis analysis showed that internal A box, positioned at +5 to +15 and B box, positioned at +78 to +88 relative to the 5’ end of BC200 RNA are crucial for BC200 RNA expression. To assess the upstream promoter of BC200 RNA gene, deletion analysis from the upstream -1010 sequence was performed. The deletion of the upstream sequence to -100 did not significantly affect the BC200 transcription, but further deletion de-creased the transcription. The promoter gradually lost its transcriptional efficiency as the deletion proceeded. When the whole upstream sequence was deleted, the transcription dropped to less than 1%. This result sug-gests that the upstream -100 sequence is essential for efficient transcription of BC200 RNA and that there might be many transcription factors binding to this upstream region. Mutational analysis of putative protein binding sites demonstrated that the -64 to -59, the -28 to -22, and -17 to -12 regions are more effective sites for efficient transcription. The effectiveness of these sites was also confirmed by competition assays. The putative binding proteins for the three sites would be cETS-2/MAF, TBP, and c-Myb, respectively, when searched through the TESS website. Overexpression of cMyb increased the BC200 RNA transcription and the cMyb siRNA treatment reduced the transcription, suggesting that the -17 to -12 region might be the binding site for cMyb. The BC200 RNA transcription was severely repressed by treatment with TBP siRNA, indicating that TBP is essential for the transcription. Three putative TBP binding sites were observed within the -100 upstream sequence, but only the mutation at the -28 to -22 region severely affected BC200 RNA transcrip-tion. Therefore, it is likely that the -28 to -22 region is the TBP binding site. However, overexpression of c-ETS-2 slightly reduced the BC200 RNA and the c-ETS-2 siRNA treatment increased the transcription, sug-gesting that c-ETS-2 would not be responsible for transcription activation by directly binding to the upstream sequence. Instead, knockdown of MAF with siRNA suppressed BC200 RNA transcription, suggesting that MAF might bind to the -64 to -59 region as a transcription activator.
A biotin-streptavidin pool-down experiment was performed to identify proteins binding to the up-stream -118 sequence. Proteins binding to the biotin-labeled DNA fragment were analyzed by MALDI-TOF-MS, and vimentin and hnRNP K were identified as binding proteins. hnRNP K gene silencing increased BC200 transcription, but decreased cellular levels of BC200 RNA. EMSA results showed that hnRNP K could bind to the upstream sequence, but the DNase I foopring failed to identify any specific binding sites on that sequence. This result indicates that hnRNP K might act as a transcription repressor directly or indirectly as well as a metabolic stabilizer for BC200 RNA. Since the treatment with hnRNA K siRNA resulted in the re-duction of endogenous BC200 RNA despite of its transcriptional suppression, metabolic stabilization of BC200 RNA would be the key factor. Knockdown of vimentin with siRNA led to induction of BC200 tran-scription. Therefore, vimentin might play a role as a transcriptional suppressor for BC200 RNA. The effects of vimentin were independent of the upstream sequence, suggesting that vimentin would affect BC200 RNA transcription without binding to the upstream sequence. Effects of proto-oncogenes c-myc and YY1 or tumor suppressor p53 on BC200 RNA biosynthesis were also examined using the respective siRNAs. BC200 RNA transcription was decreased by c-myc and p53 siRNAs, but increased by YY1 siRNA, indicating that tumor-related genes could affect BC200 RNA transcription. Taken all together, this study may provide mechanistic links between aberrant BC200 expression and specific signaling pathways related to tumorigenesis.
RNA 중합효소 III는 진핵 세포의 중합효소 중 하나로, tRNA, 5S rRNA, 그리고 non-coding RNA(ncRNA)를 전사한다. 일반적으로ncRNA유전자의 프로모터에 RNA 중합효소 III가 접근하기 위해서는 TFIIIB, TFIIIC를 포함한 여러 가지 전사 인자들이 필요하다. 특히, TFIIIB는 암 형성 유전자 단백질이나 암 억제 유전자 단백질에 의해 영향을 받는 타겟 조절자이다. 그러므로 RNA 중합효소 III에 의해 전사된 ncRNA가 암세포에서 많이 발현될 수 있다. 신경세포에서 처음 발견된BC200 (Brain Cytoplasmic 200) RNA도 RNA polymerase III에 의해 전사된다. BC200은 신경이 아닌 다른 체세포에서는 관찰되지 않아 신경특이적 세포로 간주되었다. 그러나 BC200은 신경에서 유래되지 않은 많은 종류의 종양에서 과발현된다. 그러므로 암 세포에서의 BC200 RNA의 발현을 조절하는 회로가 존재할 것으로 생각된다. BC200 RNA전사에 필요한 프로모터 부분이 아직 확인되지 않았기 때문에 이 논문에서는 HeLa 자궁경부암세포에서 BC200 RNA의 효율적인 발현에 필요한 프로모터 부분을 분석했다. 염기서열 돌연변이 분석은 5’ 끝부분을 기준으로 +5~+15부분에 위치한 내부 A상자와 +78~+88 부분에 위치한 B 상자가 BC200 발현에 중요함을 확인했다. BC200 RNA유전자 상부의 프로모터를 찾기 위해 -1010염기서열의 결실분석이 행해졌다. -100까지의 상부의 결실은 BC200전사에 많은 영향을 주지 않았으나, 그 이상의 결실은 전사를 감소시켰다. 결실이 될수록 그 프로모터의 전사 효율성이 점차적으로 떨어졌다. 전체의 앞부분 염기서열이 결실되었을 때 전사는 1% 이하로 떨어졌다. 이 결과는 상부 -100 염기서열이 BC200 RNA의 효율적인 전사에 필수적이며 많은 전사 인자들이 이 상부부분에 결합하고 있을 수 있다. 추정 단백질 결합 부분의 염기서열 돌연변이 분석은 -64~-59, -28~-22, -17~-12부분이 효율적인 전사에 더 효과적인 부분임을 입증했다. 또한 이 부분의 효과는 경쟁 실험을 통해 확인되었다. TESS 웹사이트에서 본 이 세 부분에 결합할 임의적인 단백질은 각각c-ETS-2/MAF, TBP, c-Myb이었다. c-Myb의 과발현은 BC200 RNA 전사를 증가시켰고 c-Myb의 knock-down은 BC200 RNA의 전사를 감소시켰으며 이는 -17~-12 부분에 c-Myb이 결합하는 부분일 수도 있음을 말해준다. BC200 RNA 전사는 TBP의 knock-down에 의해 뚜렷하게 감소가 되며 이는 TBP가 전사에 필수임을 뜻한다. 임의적인 세 개의 TBP 결합부분이 BC200 상부 -100 염기서열에서 관찰되었으나 오로지 -28~-22 부분의 염기서열 돌연변이 분석만이 전사에 많은 영향을 주었다. 그러므로 -28~-22 부분이 TBP가 결합하는 부분일 것이다. 그러나 c-ETS-2의 과발현은 BC200 RNA의 전사를 감소시켰으며 knock-down은 전사를 증가시켰고 이는 c-ETS-2가 BC200앞부분 염기서열에 직접 결합해서 전사를 활성화하지는 않음을 말해준다. 대신에 MAF의 knock-down이 BC200 RNA의 전사를 억제했고 이는 MAF가 전사 활성자로서 -64~-59에 결합할 것으로 보인다. 비오틴-스트렙타비딘 침전법은 BC200 앞부분 -118에 결합하는 단백질을 찾기 위해 수행되었다. 비오틴이 표지된 상부DNA 부분에 결합하는 단백질이 MALDI-TOF-MS로 분석되었고 Vimentin과 hnRNP K가 결합하는 단백질로 확인되었다. hnRNP K knock-down은 BC200 전사를 증가시키나 BC200 RNA의 세포내의 수준은 감소시켰다. EMSA는 hnRNP K가 BC200 앞부분에 결합할 수 있다는 걸 보여주었지만 DNase I footprinting은 그 염기서열에서 어떤 특이적 결합부분을 찾지 못했다. 이 결과는 hnRNP K가 직접 혹은 간접적으로 전사억제인자로 작용할 뿐만 아니라 대사 안정제로서도 작용한다는 것을 말해준다. hnRNP K의 knock-down이 전사를 억제시켰음에도 불구하고 내생의 BC200 RNA를 감소시켰기 때문에 BC200 RNA의 대사 안정화가 주요 원인일지도 모른다. Vimentin의 knock-down이 BC200 의 전사를 유발했다. 그러므로 Vimentin은 BC200 RNA의 전사 억제자로서 작용할지도 모른다. Vi-mentin의 효과는 BC200 RNA의 상부와는 독립적으로 일어나며 이는 BC200의 상부에 결합하는 것 없이 전사에 영향을 미친다는 것을 말해준다. 암 유발 유전자인 c-Myc과 YY1 그리고 암 억제 유전자인 p53이 BC200 RNA생합성에 미치는 효과 또한 각각의 siRNA로 확인되었으며 암 관련 유전자들이 BC200 RNA 전사에 영향을 줄 수 있음을 말해준다. 이 연구는 비정상적인 BC200 발현과 특이적 신호전달체계가 종양형성과 메커니즘적으로 연관이 있음을 보여준다.
