The enzymatic hydrolysis system have been developed for agarose degradation and production of D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose. First, the $\beta$-agarase AgaG1, which was isolated from Alteromonas sp. GNUM1, was cloned to Escherichia coli BL21 and overexpressed into culture medium by controlling induction condition. A new agarose hydrolysis process using AgaG1 was developed, in which the reaction temperature was adjusted stepwise to avoid gelation problem with no chemical pretreatment step. The enzyme AgaG1 was found to be very effective and highly selective. When 10.0 g/L agarose was hydrolyzed, 98% of the agarose added was converted to 3.8 and 6.4 g/L of neoagarobiose and neoagarotetraose, respectively. Next, to produce neoagarobiose from neoagarotetraose, the $\beta$-agarase DagB, which was isolated from Streptomyces coelicolor A3(2), was cloned to Streptomyces lividans TK24 and overexpressed into culture medium. The DagB could hydrolyze neoagarotetraose to neoagarobiose, whereas agarose degradation rate is relatively low. Because the optimum conditions of AgaG1 and DagB was same, the one-step process which mixing AgaG1 and DagB to produce neoagarobiose from agarose hydrolysis was developed and minimum usage of enzymes was investigated for efficient production of neoagarobiose. Using 0.875 U/ml of AgaG1 and 0.133 U/ml of DagB, 94% of agarose added was converted to neoagarobiose. Next, to produce D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose, new $\alpha$-neoagarobiose hydrolase was screened from Alcanivorax sp. A28-3. The $\alpha$-neoagarobiose hydrolase was characterized and applied to neoagarobiose degradation, and confirmed production of D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose. When 5.0 g/L neoagarobiose was converted to 2.75 g/L of galactose, showed 98% of yield. Finally, agarose was completely hydrolyzed two-stage process of enzymatic hydrolysis without any chemical pretreatment. At the first stage, agarose was hydrolyzed to neoagarobiose using AgaG1, DagB, and produced neoagarobiose was converted to D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose by using α-neoagarobiose hydrolase. As a result, 88% of agarose added was converted to galactose. Produced crude galactose solution was metabolited by Saccharomyces cerevisiae KL17 which was galactose-utilizing yeast. 8.2 g/L of crude galactose was converted to 3.37 g/L of bioethanol without cell growth inhibition effect, compared to chemical hydrolysate solution.
아가로오즈를 분해하여 갈락토오즈와 무수갈락토오즈를 생산하는 시스템이 본 연구에서 개발되었다. 우선, Alteromonas sp. GNUM1 유래의 $\beta$-agarase 유전자 agaG1을 E. coli BL21 (DE3) 에서 이종발현 시켰다. 형질전환체는 처음에 $37^\circ C$ 에서 배양한 뒤, 0.5 mM의 IPTG를 넣어 $25^\circ C$ 에서 AgaG1의 발현이 유도되었다. AgaG1의 최적 활성 pH 7.0 과 $40^\circ C$ 였다. AgaG1으로 agarose를 분해하였을 때, 주 생산물은 neoagarobiose와 neoagarotetraose로 판명되었다. Agarose를 산을 사용하는 화학적인 처리를 사용하지 않고, 단계마다 반응 온도를 조절하는 공정을 확립하여, 10 g/L의 아가로오즈를 3.8 g/L의 neoagarobiose와 6.4 g/L의 neoagarotetraose로 효과적으로 분해하는데 성공하였다. 다음으로 $\beta$-agarases AgaG1 과 DagB를 각각 E. coli BL21 (DE3)와 S. lividans TK24를 이용하여 발현시키고, DagB를 사용하여 neoagarotetraose를 neoagarobiose로 분해할 수 있음을 확인하였다. DagB가 neoagarotetraose를 neoagarobiose로 분해할 수 있었지만, agarose를 액화시키는 속도와 생산물을 만들어내는 속도가 AgaG1에 비해 느렸고, AgaG1과 DagB의 최적 활성 조건이 같았기 때문에, 두 효소를 섞어 한 번에 agarose를 neoagarobiose로 분해하는 방법이 제안되었다. 생산량에 있어서 더욱 제한적인 DagB의 사용량을 최소화 하는 방향을 우선시하여 AgaG1과 DagB의 최적 사용량이 결정되었으며, 결과적으로 0.875 U/ml의 AgaG1과 0.133 U/ml의 DagB를 사용하여 12시간 동안 10 g/L의 agarose를 9.97 g/L의 neoagarobiose로 전환시키는데 성공하였다. 다음으로 Agar를 분해할 수 있는 균주 A28-3이 새롭게 제주도에서 발견되었다. 동정 결과, 이균주는 Alcanivorax의 한 신종으로 밝혀졌으며, 세포 안 쪽에서 $\alpha$-neoagarobiose hydrolase의 활성이 있음을 발견하였다. $\alpha$-neoagarobiose 의 최적 활성 조건은 pH 7.0 과 $35^\circ C$ 으로 밝혀졌으며, neoagarobiose를 분해한 결과, 최종산물인 galactose와 3,6-anhydro-L-galactose가 생산됨을 확인하였다. Alcanivorax sp. A28-3 균주를 배양하여, 이를 파쇄하여 얻은 효소액을 사용하여, neoagarobiose와 반응시켜 98%의 neoagarobiose가 galactose와 3,6-anhydro-L-galactose로 분해되는 결과를 얻었다. 마지막으로, 위에서 얻은 세 가지 효소를 모두 사용하여, agarose를 화학적인 처리를 전혀 하지 않고 galactose와 3,6-andydro-L-galactose로 완전히 분해하였다. 공정은 두 단계로 나뉘어졌으며, 첫 번째 단계에서는 20 g/L의 agarose를 AgaG1와 DagB를 사용하여 pH 7.0, $40^\circ C$ 에서 분해하여, 16.6 g/L의 neoagarobiose를 수득하였다. 두 번째 단계에서는 neoagarobiose를 $\alpha$-neoagarobiose hydrolase를 사용하여 pH 7.0, $35^\circ C$ 에서 분해하여 최종적으로 8.73 g/L의 galactose를 수득하여, 결과적으로 74%의 agarose가 galactose로 분해되었다. 만들어진 galactose 용액 내에 미생물 발효를 저해하는 독성물질이 포함되었는지 확인하기 위하여 이를 galactose를 수월하게 이용하는 yeast 균주인 Saccharomyces cerevisiae KL17로 발효시켰고, 그 결과, 발효저해효과 없이 3.37 g/L의 바이오 에탄올을 생산하는데 성공하였다.
