Correct removal of 5’-flap structures formed by Pol $\delta$ for the maturation of Okazaki fragments during lagging strand DNA synthesis is crucial for stable maintenance of genetic materials and cell viability. In this study, we identified RAD52 as a multi-copy suppressor of dna2-K1080E, a lethal helicase-negative mutant allele of DNA2 in yeasts. Rad52 is a key recombination protein that contains recombination mediator and DNA annealing activities, playing an essential role for general homologous recombination. In contrast, overexpression of Rad51 that works conjointly with Rad52 failed to suppress the dna2-K1080E mutation, raising the possibility that Rad52 plays a unique role in facilitating processing of Okazaki fragment processing. In keeping with this notion, the recombination mediator, i.e., Rad51-binding activity of Rad52 was dispensable for the suppression of dna2-K1080E, whereas both the DNA annealing activity and the ability of Rad52 to interact with Rad59 were required. Furthermore, Rad52-QDDD/AAAA, a mutant Rad52 that is defective in binding replication protein-A did not rescue the dna2-K1080E mutation. We also found that both Rad52 and Rad52-QDDD/AAAA proteins were able to stimulate endonuclease activities of Dna2 and Rad27, indicating that stimulation of Dna2 or Rad27 by Rad52 is not a direct cause of suppression observed. In addition, Elg1 and Rsc2, required for sister-chromatid cohesion was found to be essential for the Rad52-dependent suppression of dna2-K1080E, suggesting that the suppression occurred via Rad51-independent sister-chromatid recombination event. Our findings suggest a novel Rad52-dependent, but Rad51-independent recombination pathway that could ultimately lead to removal of flaps that have escaped endonucleolytic cleavage by Dna2.
DNA 복제가 일어날 때, 연속적인 합성이 일어나는 선도가닥의 복제와는 달리, 지연가닥의 복제는 오카자키 단편들이 만들어져서 이어 붙여지는 불연속적인 방식으로 일어나는데, 여기에는 수많은 단백질들이 복잡한 방식으로 관여한다. 인간의 경우 매 세포 분열마다 약 이천만개 가량의 오카자키 단편이 만들어진다. 따라서 이러한 오카자키 단편들의 정확한 프로세싱은 유전체의 안정성을 유지하는데 있어서 매우 필수적인 과정이라 할 수 있다.
Dna2 는 오카자키 절편의 처리 과정에 매우 핵심적인 역할을 수행하는 단백질로써, displacement synthesis로 인해 생성되는 5’flap을 제거하는 역할을 담당한다. 이러한 중요성으로 인해, Dna2 는 오랜 기간 동안 국내외 수 많은 연구진들에 의해 연구되어 왔으며, 이스트에서 가장 철저히 연구된 단백질이라고 말해도 과언이 아니라 할 수 있다. 그 결과, Dna2 는 DNA replication 에서뿐만 아니라, DSB repair, checkpoint activation 에서도 중요한 역할을 담당하는 등 DNA metabolism과 유전체의 안정성 유지에 필요한 여러 분야에 걸쳐 두루 관여하는 다기능의 단백질임이 속속히 밝혀지고 있다.
Dna2 를 제거한 돌연변이가 생존할 수 없다는 것은 Dna2 는 세포의 생존에 필수적인 역할을 수행한다는 것을 의미한다. Dna2 의 helicase 활성만을 특이적으로 상실한 돌연변이 (dna2-K1080E) 역시도 생존하지 못하며, 이는 오카자키 단편의 처리과정 중에 생기는 5’-flap 을 자르는 또 다른 효소인 Rad27 의 과 발현을 통해 억제 된다는 것을 볼 때, dna2-K1080E 의 치사형질은 오카자키 단편의 처리실패에서 기인한다고 볼 수 있다. 이러한 측면에서 볼 때, Dna2 의 여러 기능 중에서도 오카자키 절편의 처리에 관여하는 기능을 탐구하는데 있어 dna2-K1080E 균주를 이용한 연구는 매우 유용하다고 할 수 있다. 이 연구에서는 Dna2 helicase 기능이 상실된 돌연변이의 치사형질을 억제 하는 요소들을 찾는 스크리닝 을 통해 발견된 단백질인 Rad52를 중심으로 오카자키 절편처리의 실패를 복구하는데 관여하는 기작에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. dna2-K1080E 의 suppressor로써의 Rad52의 발견은 Rad52에 의한 homologous recombination (HR) 이 오카자키 절편 처리과정 중 생긴 손상을 복구하는 중요한 메커니즘 이라는 것을 의미한다. 여러 recombination 경로 중에서도, Rad51은 관여하지 않는, Rad51-independent recombination이 오카자키 절편 처리과정의 실패에 의한 손상을 복구하는데 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔으며, 여기에는 Rad52 의 DNA annealing activity가 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알게 되었다. 또한 Rad52-Rad59 interaction 이 repair 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. 지금까지 Rad51 이 관여하지 않고 Rad59 이 관여한다고 알려진 DNA 손상 복구 가작으로single strand annealing, Rad51-indepndent break-induced replication, 그리고 Rad51-indepndent sister-chromatid recombination 이 있는데, 놀랍게도 Rad51-independent sister-chromatid recombination 에 중요하다고 알려진 Rsc2 를 제거 하였을 경우 suppression 이 완전히 사라짐을 확인하였다. Rsc2 는 chromosome arm 에 위치하는 sister-crhomatid cohesin을 만드는데 필수적인 역할을 수행하는데, 흥미롭게도 과거의 몇몇 유전학적 연구에서Dna2 와 sister-crhomatid cohesion 과 관여된 여러 단백질들 간의 흥미로운 연관성들을 발견하였다. 그 중, dna2-K1080E 의 치사형질을 매우 효율적으로 suppression 하였던 Elg1을 제거한 돌연변이에서는 Rad52 가 과 발현되더라도 suppression 이 일어나지 않음을 확인하였다. 또한 Dna2 와 유전학적 연관성을 가지며 sister-chromatid cohesion 의 형성에 관여하는 Ctf4 와 Ctf18을 제거한 돌연변이는 Rad52 를 과 발현시키는 것 만으로도 세포 생존에 치명적인 영향을 준다는 사실을 확인할 수 있었다. 이 연구결과를 토대로lagging strand 에서 생긴 손상은 sister-chromatid cohesion 에 의해 단단히 고정된 leading strand 의 정보를 주형으로 수선되기 때문에, Rad51 이 없이 Rad52 의 annealing activity 만으로 HR 이 일어나게 될 것이라는 가설을 제안하였다.
지금까지의 DSB 복구 기작에 대한 연구는 DSB 가 인공적으로 일어나도록 유도 한 후 그 복구기작을 연구하는 방식으로 이루어 졌었다. 그 결과, Rad51이 관여하는 DSB 복구기작이 매우 중요하며 Rad51-independent 한 DSB 복구기작은 마이너한 역할만을 수행 할 것으로 생각되어 왔다. 하지만 본 연구를 통해 우리는 DNA 복제 중 오카자키 절편의 처리실패로 생기는 치명적인 손상의 수선은 Rad51 가 관여하지 않는 전혀 새로운 방식을 통해 일어난다는 것을 밝혔다. Rad51 이 관여하는 HR 기작은 DSB resection 을 포함하여 Rad51-nucleofilament 의 형성, 그리고 Rad51의 제거 등의 여러 복잡한 과정들을 수반하는 시간이 많이 소요되는 수선과정이다. 따라서 세포분열 중 빈번하게 발생 할수 있는 Okazaki fragment 의 처리 실패로 인해 생기는 DSB 들이 이 과정으로 수선된다면 수선과정 자체가 세포에 굉장한 부담이 될 수 있다. 반면 우리의 모델은 이러한 과정들이 필요하지 않는 빠르고 단순하면서도 정교한 DNA 복구 기작으로써, DNA 복제와 동시 다발적으로 일어나며 빠르게 손상을 수선 할 수 있는 새로운 메커니즘을 제안 하고 있다. 이는 매 세포분열당 수많은 오카자키 절편들이 생성되고 이어붙여지는 복잡한 과정과 그 과정 중 초래될 수 있는 수많은 DNA 손상에도 불구하고 어떻게 세포가 정확하면서도 빠르게 유전체의 안정성을 유지하는 형태로 손상을 수선해 내는지를 설명할 수 있다. 따라서 이 연구는 어떤 방식으로 DNA 의 replication 과 recombination 이 유전물질의 안정적인 복제와 보존을 위해서 서로 긴밀히 협력하고 있는지를 보이는 중요한 관점을 제시한다.
