The Phytochrome-Interacting Factors (PIFs) are basic helix-loop-helix transcription factors that are responsible for repressing phytochrome-mediated light responses. Among them, PIF1 largely governs the inhibition of light-dependent seed germination. The specific function of PIF1 in seed germination is thought to be partly due to its high-level expression in imbibed seeds, but the associated regulatory factors have not yet been identified. Here, I showed that mutation of the EFS gene, which encodes an H3K36 di- and tri-methyltransferase, decreases the deposition of H3K36me2 and H3K36me3 at the PIF1 locus, reduces the targeting of RNA polymerase II to the PIF1 locus, and down-regulates the mRNA expression of PIF1 in imbibed seeds. Consistent with the decreased expression of PIF1 mRNA, the efs mutant geminates at a higher rate under the far-red light treated condition compared to wild type, and the expression profiles of PIF1 target genes in the efs mutant are similar to that of the pif1 mutant in imbibed seeds. Introduction of an EFS transgene into the efs mutant restored the deposition of H3K36me2 and H3K36me3 at the PIF1 locus, the high-level expression of PIF1 mRNA, the expression pattern of PIF1 target genes in imbibed seeds, and the light-dependent germination of these seeds. Conversely, introduction of a PIF1 transgene into the efs mutant restored the expression pattern of PIF1 target genes and light-dependent germination in imbibed seeds, but not the other parameters. Taken together, my results indicate that EFS confers functional specificity to PIF1 by permitting its high-level mRNA expression in imbibed seeds.
PIF1 directly binds to its targets mainly through G-box or its variants, and regulates numerous genes involved in hormone signaling and metabolism, and cell wall loosening to inhibit seed germination in the dark. Here, I identified PIF1-interacting factor, LUH. Like the pif1 mutant, the luh mutant germinates even under far-red light treated condition, in which phytochrome B exists as inactive form, indicating LUH inhibits light-dependent seed germination. Microarray analysis showed that luh mutant has a gene expression pattern similar to that of pif1 mutant or red light treated wild type. By chromatin immunoprecipitation assay, I showed that LUH is recruited to the promoter regions defined as PIF1 binding sites. The enrichment of LUH at target genes was reduced in light condition compared with that in dark, suggesting the recruitment of LUH at target genes is dependent on PIF1. ChIP-chip analysis further confirmed that among 946 LUH binding sites, 213 sites are also PIF1 binding sites, and the G-box and its variants are enriched at these sites. Taken together, my results indicate that LUH interacts with PIF1, directly regulates a subset of PIF1-regulated genes in similar pattern with PIF1, and inhibits light-dependent seed germination.
Among PIF1 direct target genes, SOMNUS (SOM), which encodes a C3H-type zinc finger protein, is a key negative regulator. However, it was not determined if PIF1 is the sole regulator of SOM expression. Public microarray data suggest that the expression of SOM mRNA is regulated also by ABSCISIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3), another key regulator of seed germination. Analysis of abi3 mutants and ABI3 overexpression lines showed that ABI3 activates the expression of SOM mRNA collaboratively with PIF1 in imbibed seeds. Chromatin immunoprecipitation analysis and electrophoretic mobility shift assay indicate that ABI3 activates the expression of SOM mRNA by directly binding to two RY motifs in the SOM promoter. I confirmed that ABI3 interacts with the PIF1 protein, however, the interaction between ABI3 and PIF1 does not affect targeting of ABI3 and PIF1 to SOM promoters. Taken together, my results indicate that ABI3 and PIF1 collaboratively activate the expression of SOM mRNA by directly binding to and interacting with each other at the SOM promoter.
식물은 주어진 환경에 적응하며 살아야 하기 때문에, 빛의 양, 온도, 습도 등을 고려하여 최적의 환경조건에서 발아를 해야 한다. 그 중 애기장대에서 빛에 의한 발아 조절은 파이토크롬이라는 광 수용체를 통해 일어난다. 빛을 인지하여 활성화 상태로 전환이 된 파이토크롬은, 광 형태 형성을 억제하고 있는 전사 인자들인 PIF 단백질들의 기능을 직접 억제함으로써 광 신호를 전달한다. 애기장대의 종자에서는 PIF1이 주로 발현되는데, 하위의 유전자들을 직간접적으로 조절하여 빛이 없는 환경조건에서는 발아를 하지 못하도록 광 신호전달을 억제한다. 본 연구에서는 애기장대 종자 단계에서 특별히 PIF1의 발현 양이 높은 이유와, PIF1이 전사 인자로써 하위 유전자들을 직접적으로 조절할 때, 또 다른 전사 인자 혹은 공동 인자와의 상호 작용을 통해 기능을 함을 밝혀냈다.
히스톤 메틸전달효소인 EFS가 H3K36 메틸화를 통해서 애기장대 종자 단계에서의 PIF1 발현을 촉진시키고, 따라서 빛이 없는 조건에서 발아가 억제될 수 있도록 한다는 것을 알게 되었다. EFS 돌연변이체는 PIF1 돌연변이체와 같이 빛이 없는 조건에서도 높은 발아율을 보였다. 유전자 발현 분석을 통해 EFS 돌연변이체에는 PIF1의 mRNA와 단백질 발현이 줄어들어 있었고, PIF1에 의해 발현이 조절되는 그 하위 유전자들의 발현 또한 PIF1 돌연변이체에서와 비슷한 양상으로 조절 받고 있었다. EFS는 유전자의 발현과 정적 상관관계를 보이는 H3K4 혹은 H3K36 메틸화를 촉매 하는 히스톤 메틸전달효소이다. 따라서, EFS 돌연변이체에서는 대상 유전자의 메틸화 정도가 감소하게 되는데 실제 PIF1의 프로모터와 암호영역에서 H3K4의 메틸화 정도는 차이가 없었지만, 2차와 3차 메틸화된 H3K36의 양이 줄어있었다. 뿐만 아니라 EFS 돌연변이체에는 RNA 중합효소 II가 상대적으로 PIF1 프로모터와 암호영역에서 줄어들어 있었는데 이는 PIF1의 발현이 감소한 것과 일치한다. 즉, EFS는 H3K36의 메틸화를 통해 RNA 중합효소 II를 직접 혹은 간접적으로 PIF1 유전자로 불러들임으로써 PIF1의 mRNA를 발현시키고, 이를 통해 빛이 없는 조건에서는 발아가 되지 않도록 발아 과정을 억제하는 역할을 한다고 생각할 수 있다.
PIF1에 의한 광 신호전달 과정을 좀 더 이해하기 위해 효모단백질잡종법을 수행하였고, 이를 통해 PIF1과 결합하는 LUH 단백질을 찾게 되었다. PIF1 돌연변이체와 마찬가지로 LUH 돌연변이체 또한 빛이 없는 조건에서도 높은 발아율을 보였다. 빛에 의한 유전자 조절과 PIF1 돌연변이에 의한 유전자 조절은 서로 비슷한 양상을 보이는데, LUH 돌연변이체에서도 지베렐린과 ABA 관련 유전자를 포함한 상당수의 유전자들이 빛 혹은 PIF1 돌연변이에 의한 양상과 비슷하게 유전자 발현이 조절되고 있었다. LUH 단백질은 PIF1과 달리 DNA에 직접 결합할 수는 없다. 하지만 ChIP을 통해 LUH 또한 PIF1이 결합하는 유전자의 프로모터 부위에 결합할 수 있고, 빛을 처리하여 PIF1이 비활성화된 조건에서는 LUH의 결합능력이 감소하는 것을 알 수 있었다. 즉, DNA에 직접 결합할 수 없는 LUH 단백질은 PIF1을 통해 특정 염기서열을 가지는 DNA에 함께 결합하여 유전자의 발현을 같은 양상으로 조절한다고 생각할 수 있다. ChIP-chip 분석을 통해 LUH 또한 PIF1이 결합한다고 알려진 DNA와 같은 위치, 즉 주로 G-box나 G-box variant motifs에 결합함을 확인하였다.
PIF1이 유전자의 프로모터에 직접 결합하여 발현을 조절하는 유전자 중 하나인 SOM은 종자가 성숙(seed maturation)되는 동안 발현이 증가한다. 이 과정에서 또 다른 전사 인자인 ABI3가 필요하다는 것을 ABI3 돌연변이체와 과발현 형질전환체를 통해 알게 되었다. ABI3는 RY motif를 통해 DNA에 직접 결합하는데, SOM 프로모터에는 RY motif가 존재하였고, ChIP을 통해서 ABI3는 이 RY motif에 직접 결합하여 발현을 촉진함을 확인하였다. 한편 종자 흡수 단계(seed imbibition)에서 SOM의 발현을 촉진하는 ABI3와 PIF1은 단백질간 상호작용을 하여 전사 인자로써의 기능을 함께 하지만, 두 단백질이 SOM 프로모터에 결합하기 위해서 이 상호작용이 반드시 필요한 것은 아니다. 즉, ABI3와 PIF1은 종자 단계에서 각각 SOM 프로모터 부위에 직접 결합하여 SOM의 발현을 함께 촉진시킴으로써 발아를 억제한다.
