Bottom-up approaches using self-assembled biomolecules for nanostructure building promises advantageous features like biocompatibility, nanometer accuracy. In this study, we used lipid and DNA molecules for building block to make nanostructures and monitored the protein binding and folding process on the nanostructure using single molecule techniques. SNARE proteins, the core machinery of membrane fusion drives membrane fusion once they were incorporated into the vesicle. We used single molecule FRET technique to observe their lipid mixing ability, and protein complex formation dynamics. We observed SNARE dependent lipid mixing and SNARE complex formation to reveal that the SNARE complex formation kinetics is actually cooperative. We also developed content mixing assay using self-quenching dyes to observe calcium dependent content mixing by neuronal SNARE and synaptotagmin I.
Next we used magnetic tweezers to reveal the folding pathway and intermediate states of DNA origami process. DNA origami provides a versatile tool to design and build DNA based nanostructures with arbitrary shape and modification sites. We used the selective denaturing capability of magnetic tweezers to separate the binding of staple strands from the folding process and simplified the molecular processes during the nanostructure folding. The folding process was finished within 10 minutes which was 100 times faster than conventional thermal folding method.
이 논문에서는 자가조립되는 생체 분자들을 이용하여 나노구조를 형성하고 이 나노구조에 대해서 단분자 기술들을 이용한 연구를 수행하였다. 수용액 상에서 인지질 이중층으로 만들어진 수십나노미터 지름의 소포를 인지질 분자들의 자가조립과정을 통해 제작하였다. 계면활성제 분자를 이용하여 인지질 구조를 분해하고 재조립하는 과정을 통해 소포를 제작하면 소포에 막 단백질을 삽입하여 막 단백질의 기능을 연구할 수 있는 나노구조를 만들 수 있다. 본 연구에서는 특히 생체막 융합 과정의 핵심 역할을 담당하는 스네어 (SNARE) 단백질을 소포에 삽입하여 스네어 단백질들의 결합과 이에 의한 생체막 융합을 관찰하였다. 스네어 단백질은 두 종류의 t스네어 단백질과 1 종류의 v스네어 단백질로 이루어져 있는데 t스네어 단백질을 한 소포에 삽입하고 v스네어 단백질을 다른 소포에 삽입한 후 두 소포를 섞어주면 스네어 단백질 사이의 결합에 의해 인지질 막의 융합이 일어나고 이를 인지질에 섞어놓은 형광분자 사이의 에너지 전달과정을 통해 관찰할 수 있었다. 비슷하게 스네어 단백질 자체에 형광분자를 달고 스네어 단백질의 결합과정을 단분자 수준에서 관찰한 결과 스네어 단백질의 결합이 한 분자씩 독립으로 일어나는 대신 협동적으로 더욱 빠르게 일어난다는 사실을 관찰하였다. 한편 스네어 단백질에 의해서 소포 내부의 물질이 섞이는 과정은 신경전달과정에 필수적이지만 이를 관찰할 수 있는 좋은 실험방법의 부재로 인해 연구가 미흡한 실정이었다. 이를 해결하기 위해 고농도의 형광물질에서 일어나는 자가 형광감소 현상을 이용하였다. 자가 형광감소 현상의 특성을 파악하기 위하여 sulforhodamine B의 자가 형광감소 특성을 소포 내부와 외부에서 측정하여 기준 데이터를 얻었다. 이 기준 데이터를 바탕으로 50 mM 농도의 sulforhodamine B를 소포에 넣고 synaptotagmin 1 단백질의 칼슘 농도에 대한 소포 내부물질이 섞이는 과정을 관찰하고 실제 칼슘 농도에 의해 소포 융합이 촉진되는 것을 발견하였다.
DNA오리가미는 원하는 형태의 나노구조를 DNA 기반으로 만들어낼 수 있는 기술이다. 그 동안 다양한 형태의 DNA 나노구조를 사람들이 개발하였지만 실제 나노구조가 접히는 과정에 대한 연구는 잘 되어있지 않았다. 본 연구에서는 생체 분자 하나에 힘을 가하면서 모양을 관찰하는데 특화되어있는 단분자 자기집게를 이용하여 나노구조의 접힘과정을 관찰하였다. 온도변화를 이용하여 나노구조를 접는 기존의 방식은 시간이 오래 걸리고 분자반응이 섞여서 일어나기 때문에 중간단계의 예측이 어려운 단점이 있었다. 이 연구에서는 자기집게를 이용하여 DNA의 내부구조를 풀어낸 후 이를 나노구조로 접어주는는 접음 DNA를 붙임으로써 기존 방식에 비해 100배 빠른 속도로 나노구조를 접을 수 있었다. 또한 여러 DNA를 동시에 당길 수 있는 자기집게의 특성을 이용하여 한번에 약 30개의 나노구조를 동시에 접고 이를 단분자 FRET기술로 확인할 수 있었다.
