Asthma is a chronic inflammatory disease of the lower airways characterized by recurrent airway obstruction and wheezing. There are several causes of asthma. In immunological aspect, the main cause of asthma is an allergen such as secretions from house dust mite, fungal protease, pollen. One of the most important allergen is proteases from fungi. The activity of protease is thought to be important to induce the Th2-mediated immune response. Generally, protease activity of Aspergillus oryzae is high enough to develop allergic asthma. I secured the cDNA of wild type A. oryzae protease, then mutated active sites of A. oryzae protease and optimized codon for bacterial expression. The mutant A. oryzae protease could be induced the expression of 46.7 kDa sized protein in $16$T_H2$ for 16h under 0.2-0.4 mM of IPTG. The A. oryzae protease was purified by using the $Ni^{2+}$ His binding bead column. Purified mutant A. oryzae protease was being lost protease activity and used to induce allergic asthma in mouse model. In the group of mice administrated by mutant protease, lung inflammation and bronchoalveolar lavage (BAL) eosinophilia were significantly lowered com-pared to a group of mice which was administrated with wild type Aspergillus protease (AP). Furthermore, airway hyper-responsiveness (AHR), total BAL cell counts and BAL glycoprotein secretion were significantly lowered with administration of mutant protease. Immune tolerance rather than immune stimulation was detected in mutant protease administered group. Inactivated A. oryzae protease can control the differentiation and function of helper T cell and eventually reduce allergic asthma. In the future, I expect to develop asthma vaccine by manipulating protease activity.
알레르기성 천식은 만성의 기도염증과 기도의 과민성으로 대표되는 복잡한 질병으로 공중보건의 주요 문제이기도 하며 최근에 더욱 발병률이 높아져 효과적인 치료방법이 필요한 서구화 질병이다. 면역학적인 측면에서 알레르기성 천식은 다양한 종류의 알레르겐을 통해 면역 세포인 T cell을 type 2 helper T cell ($T_H2$ cell) 로 분화를 유도하여 Interluekine-4 (IL-4), IL-5, IL-13 등의 다양한 사이토카인을 분비하여 mast cell, 호염구를 폐로 불러들이고 특히 호산구가 기도 및 폐로 모이면서 폐 염증 반응을 일으키는 동시에 기도의 점막을 따라 IgE의 분비를 증가시킨다. 결국, 알레르기성 천식은 알레르겐에 의한 $T_H2$ cell에 의한 과도한 면역반응이 일어나 폐 염증반응과 기도 과민반응을 일으켜 호흡곤란을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이렇게 복잡한 질환임에도 불구하고 현재 알레르기성 천식에 대한 치료는 증상 완화에만 머무르고 있는 실정이기 때문에 면역세포 특히 $T_H2$ cell의 분화 및 증식을 조절할 수 있는 근본적인 치료방식이 필요한 실정이다. 현재 천식의 발병원인으로 알려져 있는 주요 알레르겐에는 집 먼지 진드기의 분비물, 진균류의 프로테아제, 꽃가루 등이 있다. 이들 알레르겐의 대표적인 특성은 protease activity를 가지고 있다는 것이다. 이 protease activity를 가진 알레르겐은 상피세포의 tight junction을 분해하는 동시에 여러 면역 세포에 분포되어 있는PAR-2를 활성화시켜 $T_H2$ cell에 의한 알레르기성 천식 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이런 점에 착안하여 열이나 저해제를 통해 protease activity를 없앤 진균류 프로테아제를 이용하여 쥐를 면역반응 시킨 후 Aspergillus protease (AP)로 알레르기성 천식을 유도한 경우 생리식염수로 면역반응을 시킨 후 천식을 유발시킨 대조군에 비해 알레르기성 천식의 유발을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 이 예비 실험 결과를 근거로 프로테아제 알레르겐 중에서 상대적으로 덜 알려져 있지만 protease activity가 높은 A. Oryzae 의 프로테아제에서 효소 활성부분 (active site)을 변형시키고 박테리아에서 발현시키기 위해 codon optimization을 시켰다. 이들 효소 활성에 중요한 아미노산들은 종간 아주 잘 유지되어 있음을 확인했고, 162번 aspartic acid, 193번 histidin, 349번 serine이 아주 중요한 부분임을 확인했다. 이들 아미노산을 alanine 혹은 arginine으로 교체하면 protease activity를 제거할 수 있을 것으로 예상했다. 이 유전자를 pET21a 벡터로 옮긴 후, 0.2-0.4 mM의 IPTG 농도로 $16^\circ C$ 온도에서 16시간을 배양하였더니, 다른 조건에서보다 프로테아제의 발현이 잘 일어났다. 또한 실제 발현된 프로테아제의 활성 정도를 측정해본 결과, 그 활성도 또한 열로 비활성시킨 AP 보다 더 활성이 없는 것으로 나타났다.
변형된 프로테아제(Mutant protease)를 이용하여 실제로 이들이 알레르기성 천식의 유발에 어떠한 영향을 미칠 지를 확인하기 위해 총 네 가지의 그룹으로 나누어 실험을 설계하였다. 첫 째는 생리 식염수만 주입한 그룹, 둘 째는 AP로 천식을 유발시킨 그룹, 세 째는 열을 이용하여 비활성 시킨 AP를 처리한 그룹, 마지막으로 유전자를 변형시켜 비활성 시킨 프로테아제를 처리한 그룹이었다. 그 결과 변형된 프로테아제를 처리한 쥐에서는 비 활성된 AP를 처리한 쥐에서와 마찬가지로 알레르기성 천식의 대표적인 반응인 폐 기관지 세척액 (BAL) 내에서의 glycoprotein의 분비, 염증을 일으키는 세포의 밀집 현상, $T_H2$ cell의 사이토카인의 분비, 기도 저항성 등이 상당 수준 낮아져 있는 것을 확인했다.
이상의 결과에서, 천식을 유발하는 대표적인 알레르겐을 유전자 변형을 통한 비활성 형태의 프로테아제로 발현시키고 이들의 활성이 없는 것을 확인하였으며. 동물모델을 이용하여 그 protease activity가 알레르기성 천식에 직접적인 연관이 있음을 증명하였다. 또한 앞으로 선행실험에서 보였듯이 AP를 이용한 알레르기성 천식을 유발하기 전에 이 비활성 프로테아제를 통해 면역반응을 일으킨다면 AP가 유발하는 천식에 대한 예방효과를 가질 수 있을 것으로 기대되며, 천식의 예방에 도움이 될 수 있는 치료제로써의 가능성을 확인했다.
