Part I. $CD11b^{+}Gr1^{+}$ Bone Marrow Cells Ameliorate Liver Fibrosis by Producing Interleukin-10 in Mice
Recent clinical trials and animal models demonstrated that infusion of bone marrow cells (BMCs) is an effective therapy for liver cirrhosis, but the underlying mechanism is still unclear. Here, we investigated the early effects of BMC infusion and identified the subsets of BMC showing antifibrotic effects in mice with two weeks of carbon tetrachloride-induced liver fibrosis. In addition, an interaction between BMCs and activated hepatic stellate cells (HSCs) were investigated. Within 24 hours, infused BMCs were in close contact with activated HSCs, which was associated with reduced liver fibrosis, enhanced hepatic expression of interleukin (IL)-10, expanded Tregs but decreased macrophage infiltration in the liver. Moreover, major subsets of infused BMCs, which produced IL-10, were $CD11b^{+}Gr1^{high}F4/80^{-}$ and $CD11b^{+}Gr1^{+}F4/80^{+}$ BMCs in the fibrotic liver. In addition, we found that BMC-derived IL-10 is mandatory for anti-fibrotic effects of BMC infusion, because IL-10-deficient ($IL-10^{-/-}$) BMCs failed to reproduce these effects in the fibrotic livers. In vitro, $CD11b^{+}Gr1^{high}F4/80^{-}$ and $CD11b^{+}Gr1^{+}F4/80^{+}$ BMCs expressed more IL-10 after co-culture with activated HSCs. In contrast, the expression of collagen and $\alpha$ -smooth muscle actin in HSCs was suppressed by them. Indeed, these effects were either enhanced or abrogated, respectively, when BMCs co-cultured with $IL-6^{-/-}$ and retinaldehyde dehydrogenase 1 $(RALDH1)^{-/-}$ HSCs. Similar to murine data, human BMCs expressed more IL-10 after co-culturing with human HSC lines (LX-2 or hTERT). In conclusion, activated HSCs increase IL-10 expression in infused BMCs ($CD11b^{+}Gr1^{high}F4/80^{-}$ and $CD11b^{+}Gr1^{+}F4/80^{+}$), which in turn ameliorates liver fibrosis. Our findings could enhance the design of BMC therapy for liver fibrosis.
Part II. BMC infusion with TLR3 Agonist Poly I:C Reverse Advanced Stages of Liver Fibrosis in Mice.
Immunotherapy based on activation of innate immunity (interferon-$\gamma$ [IFN-$\gamma$] and natural killer [NK] cells) has been investigated to treat the patients with liver fibrosis as well as cancer and viral diseases. However, in patients with chronic liver fibrosis or cirrhosis, this immunotherapy failed to show treatment effects due to the resistance of activated hepatic stellate cells (HSCs) to IFN-$\gamma$ /NK cells treatment. Therefore, we infused bone marrow cells (BMCs) prior to treatment of polyinsinic-polycytidylic acid (poly I:C), which is a potent activator of NK cells, in advanced liver fibrosis induced by a 10-week carbon tetrachloride ($CCl_4$) challenge to overcome the resistance of activated HSC to IFN-$\gamma$ /NK cells. Poly I:C treatment followed by BMC infusion significantly reduced liver fibrosis and $\alpha$ -smooth muscle actin $(\alpha -SMA)^{+}$ activated HSCs compared with poly I:C treatment alone and BMC infusion alone. In vitro experiment, BMCs enhanced 8-day cultured (intermediately-activated) HSCs killng by NK cells via upragulation of death receptors, Fas and tumor necrosis factor receptor type 1 (TNFR1), in the HSCs, although BMCs directly reduced NK cell cytotoxicity via interleukin (IL)-10. Moreover, the upregulation of TNFR1 in activated HSCs by BMCs was confirmed in vivo. The direct effects of BMCs to NK cells reducing those cytotoxicity contributed to reduce poly I:C-related toxicities in vivo. Our findings provide novel therapeutic way to overcome the resistance of intermediately-activated HSCs to IFN-$\gamma$ and poly I:C treatment for patients with chronic liver fibrosis or cirrhosis.
Part I. $CD11b^{+}Gr1^{+}$ Bone Marrow Cells Ameliorate Liver Fibrosis by Producing Interleukin-10 in Mice
최근의 임상실험과 동물연구는 골수세포의 주입이 간경변증에 대한 효과적인 치료임을 입증하였다. 그러나 골수세포의 치료효과에 대한 메카니즘은 명확히 알려져 있지 않은 상태이다. 본 연구에서는 2주간의 사염화탄소로 유도한 마우스의 간경변증에서 골수세포주입의 초기 효과, 그리고 골수세포와 활성화된 간성상세포간의 상호작용을 연구하였다. 골수세포 주입은 효과적으로 간섬유화를 호전시켰고, 콜라겐 합성을 통해 간섬유화를 유도하는 주 세포인 활성화된 간성상세포를 유의하게 감소시켰다. 골수세포주입 후 24시간 내에, 주입된 골수세포는 간내로 이동하여 활성화된 간성상세포와 근접하여 있었으며, 이러한 골수세포의 효과는 간내 인터류킨-10의 발현증가, 억제T세포의 증가, 간내 대식세포의 침윤감소로 이어졌다. 또한 인터류킨-10 유전자가 제거된 골수세포를 주입하였을 때에는 위에서 나열된 골수세포의 항섬유화효과가 나타나지 않았기 때문에, 골수세포에서 발현된 인터류킨-10이 골수세포치료의 초기 항섬유화효과에 필수적임이 확인되었다. 또한 생체외 실험에서 $CD11b^{+}Gr1^{high}F4/80^{-}$ 를 발현하는 골수세포와 $CD11b^{+}Gr1^{+}F4/80^{+}$ 를 발현하는 골수세포가 활성화된 간성상세포와 공동배양후에 더욱 높은 인터류킨-10을 발현하였다. 또한 골수세포에 의해 발현된 인터류킨-10은 활성화된 간성상세포의 콜라겐과 $\alpha$ -smooth muscle actin의 발현을 억제하였다. 골수세포를 인터류킨-6 유전자가 제거된 간성상세포와 공동배양하였을때는 골수세포의 인터류킨-10 발현이 더욱 크게 증가하여 간성상세포에서 발현되는 인터류킨-6가 골수세포의 인터류킨-10발현을 감소시킴을 확인하였다. 골수세포를 레티노산을 합성하는 retinaldehyde dehydrogenase (RALDH) 유전자가 제거된 간성상세포와 공동배양하였을 때는 골수세포의 인터류킨-10 발현이 크게 감소하여 간성상세포가 발현하는 레티노산이 골수세포의 인터류킨-10 발현에 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다. 간경변증 환자에서 채취된 골수세포를 인간 간성상세포주인 LX-2와 hTERT 세포와 공동배양하였을 때에도, 마우스 실험과 동일하게 골수세포에서 인터류킨-10의 발현이 증가하였다. 결론적으로, 활성화된 간성상세포는 주입된 골수세포의 인터류킨-10의 발현을 증가시키며, 골수세포에서 발현된 인터류킨-10은 간성상세포를 억제함으로써 골수세포주입이 간섬유화를 호전시킨다는 것을 입증하였다. 본 연구결과는 향후 간경변증 환자를 대상으로 하는 골수세포치료의 효과를 증가시킬 수 있는 메카니즘을 제시하였다.
Part II. BMC infusion with TLR3 Agonist Poly I:C Reverse Advanced Stages of Liver Fibrosis in Mice.
선천성면역의 활성화를 기반으로한 인터페론-$\gamma$ 와 자연살해세포를 이용한 면역치료는 종양이나 바이러스 감염성 질환뿐만아니라 간섬유화 환자를 대상으로도 연구되고 있다. 그러나 만성 간섬유화 또는 간경변증 환자에서는 이러한 면역치료가 효과를 보이지 못하고 있으며, 이에대한 원인으로는 콜라겐을 합성하여 간섬유화를 일으키는 주 세포인 활성화된 간성상세포가 면역치료에 대해 저항성을 지니고 있기 때문으로 보고되어 있다. 이전 연구에서 간섬유화에 대한 골수세포치료는 활성화된 간성상세포를 억제하는 것으로 보고되었기 때문에, 본 연구에서는 강력한 자연살해세포의 활성체인 polyinsinic-polycytidylic acid (poly I:C)를 이용한 면역치료 전에 골수세포를 주입하여 상술된 간성상세포의 저항성을 극복하고자 하였다. 마우스에서 후기 간섬유화를 유도하기 위해 사염화탄소를 10주간 복강내 주입하였다. 그 결과, 골수세포 주입 후의 poly I:C 면역치료는 골수세포주입 단독치료나 poly I:C 단독치료와 비교하여 유의하게 간섬유화를 호전시키고 $\alpha$ -smooth muscle actin을 발현하는 활성화된 간성상세포를 감소시켰다. 생체외 실험에서는 골수세포가 자연살해세포의8일간 배양하여 중기 활성화된 간성상세포의 세포사멸 유도를 유의하게 증가시켰음이 확인되었다. 본 연구에서 골수세포는 직접적으로는 자연살해세포의 세포독성을 감소시키지만, 활성화된 간성상세포의 세포사멸을 유도하는 Fas와 tumor necrosis factor receptor type 1 (TNFR1)의 발현을 증가시켜, 결과적으로 자연살해세포에 의한 간성상세포의 세포사멸이 증가됨이 확인되었다. 이러한 골수세포에 의한 간성상세포의 TNFR1의 발현 증가는 마우스를 이용한 생체내 실험에서도 확인되었다. 또한 골수세포에 의한 자연살해세포의 세포독성 억제효과는 poly I:C 면역치료의 치료독성을 감소시켜주는 효과가 있음이 확인되었다. 본 연구는 면역치료전의 골수세포주입이 간성상세포의 치료저항성을 감소시키고 면역치료의 독성 또한 감소시킴을 입증함으로서, 향후 간섬유화나 간경변증 환자를 대상으로한 임상연구에서 인터페론-$\gamma$ 나 poly I:C 기반의 면역치료의 효과를 증대시킬 수 있는 기전을 밝혀냈다.
