Part Ⅰ. Toll-like receptor 3 activation in Kupffer cells and stellate cells attenuates alcoholic liver injury by direct interleukin-10 production and decreased endocannabinoid production in mice
Background & Aims : Hepatic stellate cells (HSCs) and Kupffer cells are involved in development of alcoholic liver injuries such as steatosis and inflammation by producing endocannabinoids and inflammatory mediators, respectively. The important function of toll-like receptor (TLR) 4 on Kupffer cells and hepatic stellate cells (HSCs) has been well documented in alcoholic liver injury. However, little is known about the role of TLR3. Therefore, we tested whether TLR3 activation in HSCs and Kupffer cells could attenuate alcoholic liver injury in vivo, and investigated its possible mechanisms in vitro.
Materials and Methods : Alcoholic liver injury was achieved by feeding wild type (WT), TLR3 knockout ($TLR3^{-/-}$) and interleukin (IL)-$10^{-/-}$ mice with high-fat diet plus binge ethanol drinking for 2 weeks. To activate TLR3, polyinosinic-polycytidylic acid (poly I:C) was injected into mice. For in vitro studies, freshly isolated HSCs and Kupffer cells were treated with poly I:C.
Results : In WT mice, poly I:C treatment reduced alcoholic liver injury and fat accumulation by suppressing nuclear factor-$\kappa$ B activation and sterol response element-binding protein 1c expression in the liver. In addition, poly I:C treatment induced natural killer (NK) cell-mediated apoptosis of HSCs which responsible for the decreased fat
deposition in hepatocytes. Furthermore, importantly, freshly isolated HSCs and Kupffer cells from poly I:C treated mice showed enhanced expression of IL-10 compared to controls. Infiltrated macrophage numbers and the expression of tumor necrosis $factor-\alpha$, monocyte chemoattractant protein-1 and IL-6 on these cells were decreased after poly I:C treatment. In vitro, poly I:C treatment enhanced the expression of IL-10 via a TLR3-dependent
mechanism in HSCs and Kupffer cells. However, the protective effects of poly I:C on alcoholic liver injury were abrogated in $TLR3^{-/-}$ and $IL-10^{-/-}$ mice.
Conclusions : TLR3 activation ameliorates alcoholic liver injury via the stimulation of IL-10 production in HSCs and Kupffer cells, and suppression of HSCs by increased NK cell cytotoxicity. Our findings suggest that targeting the TLR3 activation could be a novel therapeutic ways for the treatment of alcoholic liver injury.
Part Ⅱ. Ginsenoside F2 treatment ameliorates alcoholic liver injury by increased
regulatory T cells and IL-10 production in mice
Background & Aims : It has been reported recently that an intestinal metabolites of ginsenoside has diverse protective effects against liver injury. However, specific mechanism how ginsenoside metabolites attenuated liver injury was still unclear, especially in alcohol-mediated liver injury. Here, we explored the possibility whether ginsenoside F2, a ginsenoside metabolites, treatment could be a preventing way in the progression of alcoholic liver injury.
Materials and Methods : Alcoholic liver injury was achieved by feeding wild type (WT) mice with binge ethanol drinking for 2 weeks with or without ginsenoside F2. Hepatic mononuclear cells, Kupffer cells, stellate cells (HSCs) and regulatory T cells (Tregs) were isolated, and subjected to in vitro study.
Results : Alcoholic liver injury was attenuated by gindenoside F2. Ginsenoside F2 treatment reduced infiltrating macrophages/Kupffer cells and granulocytes in the liver.
Activation of Kupffer cells and HSCs was decreased, and IL-10 induction was increased in ex vivo isolated .Kupffer cells and HSCs. We further confirm the increased IL-10 in both cells in vitro. Tregs population and its total counts in liver was increased by ginsenoside treatment, however, coculture with HSC suppress the activity of Tregs directly. Reduced fat accumulation was related to decreased endocannabinoid-producing gene expression by ginsenoside F2 treatment. All the preventive effect of ginsenoside was abrogated in more chronic model of 4 weeks mice. We investigated the possibility of ginsenoside F2 as a therapeutics for attenuating alcoholic liver injury in mice.
Part I. Toll-like receptor 3 activation in Kupffer cells and stellate cells attenuates alcoholic liver injury by direct interleukin-10 production and decreased endocannabinoid production in mice
알코올성 간손상에 있어 쿠퍼세포와 간성상세포는 다양한 염증성 싸이토카인과 지방축적유도물질을 분비하며, 이 때 톨-유사수용체 4 (Toll-like receptor (TLR) 4)의 역할이 중요한 것으로 알려져 있다. 반면, TLR3는 TLR4와 겹치는 하위신호전달체계를 가지고 있지만, 그 작동기전이 상당부분 다른 특성이 있는 것으로 알려져 있어서 본 연구에서는 알코올성 간손상에 있어서 TLR3의 활성화가 쿠퍼세포와 간성상세포에 어떤 영향을 미치는 지에 대해 연구하였다.
총 2주간의 알코올 경구투여를 통해 알코올성 간손상을 유도하였고 동시에 polyinosinic-polycytidylic acid (poly I:C)를 이용해 TLR3를 활성시켰다. Poly I:C 투여군에서 간손상과 지방축적이 감소하였음을 확인하였으며, 또한 poly I:C 투여군에서 활성화된 간성상세포가 더 많이 사멸되는 현상과 간세포에서 지방축적유도 인자의 감소를 확인하였다. 동시에 개별적으로 분리된 쿠퍼세포와 간성상세포에서 IL-10의 발현이 유의하게 증가한 현상을 발견하였다. 실제로 간조직내에서 활성화된 대식세포의 수가 감소하였고, 이들이 분비하는 염증성 싸이토카인인 $TNF-\alpha$, MCP-1, 그리고 IL-6의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 개별 세포 독립실험에서도 poly I:C 처치에 따라 IL-10의 생산이 증가한 것을 확인하였고, 이는 TLR에 의존적으로 일어남을 확인하였다. Poly I:C의 알코올성 간손상 억제효과는 TLR3-/-, IL-10-/-, 그리고 TLR4-/- 마우스에서는 관찰되지 않았다.
이상을 바탕으로 알코올성 간손상에 있어 TLR3 활성화는 간성상세포와 쿠퍼세포의 IL-10 생산을 촉진하는 동시에 자연살해세포의 간성상세포 사멸을 촉진하여 간손상을 보호하는 것으로 나타났으며, 이를 이용한 알코올성 간손상의 새로운 치료법을 제시하였다는 데에 본 연구의 의의가 있다.
Part Ⅱ. Ginsenoside F2 treatment ameliorates alcoholic liver injury by in-creased regulatory T cells and IL-10 production in mice
인삼추출물의 대사물질이 간 보호 효과가 있다는 것은 경험적으로 널리 알려져 왔으나, 그 구체적인 기전에 대한 연구가 많지 않았고, 특히 알코올성 간손상에 있어서의 효능에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다. 이에 본 연구에서는 진세노사이드 F2를 대상으로 알코올성 간손상에서의 효과를 검증하고자 하였다.
2주간의 알코올 경구투여를 통해 알코올성 간손상을 유도하였고 진세노사이드 F2를 동시에 경구로 투여하였다. 진세노사이드 F2를 처치한 군에서 알코올성 간손상이 감소하였으며, 동시에 간조직 내의 대식세포와 과립구의 침윤이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 쿠퍼세포와 간성상세포의 염증성 싸이토카인의 발현은 줄어든 반면, IL-10은 증가한 것을 확인하였다. 또한 진세노사이드 F2처치에 따라 간성상세포의 엔도카나비노이드 유도 유전자 활성이 감소하여 간세포에서 지방축적유전자의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 흥미롭게도 진세노사이드 F2 처치군에서는 조절성 T세포 (Tregs)의 분포와 수가 모두 증가함을 확인하였다. 하지만 간성상세포와 Treg의 공동배양에서는 오히려 Treg의 수가 감소함을 알 수 있었다.
이를 바탕으로 진세노사이드 F2의 알코올성 간손상 보호효과를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 금주 이외에 뚜렷한 예방 및 치료책이 없었던 알코올성 간손상을 완화시킬 수 있는 새로운 치료점으로서 진세노사이드 F2의 가능성을 확인하였다.
