An amperometric enzyme electrode is described for the simple assay of rifamycin B and rifampicin. An enzyme, rifamycin B oxidase, was successfully purified from Humicola spp. To construct a enzyme electrode, a direct binding method, where a Clark electrode was coated by a solution of enzyme, BSA, and glutaraldehyde ; a thin layer of cross-linked protein coating the electrode surface. The electrode can be used for assay of rifamycin B and rifampicin, without necessity for extensive separation and pretreatment. The immobilized enzyme is stable for 1 week, with small loss of enzyme activity, and exhibits a linear response to rifamycin B over the range of 0.4mM to 2.5mM and rifampicin over the range of 0.15mM to 1.0mM by maximum velocity method. The only limitation is the long response time (10 min). After preparation, the buffer is the only reagent needed.
Humicola spp. 로 부터 ammonium sulfate 분획침전, bentonite 흡착 ,DEAE-cellulose 컬럼, Sephdex G-200 컬럼, hydroxylapatite 컬럼을 이용하여 분리하였다. 최종적으로 0.5mg의 효소를 얻었는데 그때의 specific activity는 3160unit/mg protein 이었다.
간단하고 손쉽게 rifamycin B 와 rifampicin을 정량하기 위해 BSA 와 동시 고정된 효소막을 Clark 전극 표면에 부착하여 효소전극을 만들었다. 효소전극은 55℃ 와 pH 7.5 에서 최대의 활성을 보였다.
최대속도 방법으로 표준곡선을 만들었을 경우 rifamycin B는 0.45와 0.25mM에서 직선적인 반응을 보였다. Rifampicin은 0.15와 1.00mM에서 직선적인 반응을 보였다. 효소 전극의 안정성은 일주일간 유지 되었다.
