Ethyl acetate, one of the esters, has pleasant, fruity and flower-like aroma, which is produced by several microorganisms. H. anomala has been known to produce ethyl acetate most abundantly under aerobic condition. For an exact quantitative analysis of ethyl acetate, direct injection of culture broth or esterase (in whole cells) reaction mixture into gas chromatography was employed. Ethyl acetate is very volatile and its volatility to ethanol is about 20 times greater. Therefore, evaporated ethyl acetate during fermentation was recovered by trapping system.
Ethanol and ethyl acetate were identified as main volatile components and the rest were acetic acid, n-propyl acetate and isobutyl acetate. Ethyl acetate formation during cultivation was increased with a rapid cell growth and decreased with a shortage of glucose and ethanol in a culture broth.
Esterase activity in whole cells was highest in 21 hr aged cells with a broad range of optimum, which were in an early stationary phase. Esterase in whole cells was most active at pH 7.0, 30℃ and its activation energy was 25.9 Kcal/mole in the range of 10℃-30℃. Esterase in whole cells hydrolyzed ethyl acetate gradually and slightly inhibited by 10 mM - 100 mM or above ethyl acetate. Ethyl acetate was also produced from ethanol and acetic acid anaerobically by reverse reaction of esterase in whole cells.
에칠 아세테이트를 가장 많이 생성하는 균체로 알려진Hansenula anomala 를 배양하면서 에칠 아세테이트의 생성과 균체가 지니고 있는 에스터라제의 특성에 대하여 살펴보았다. 배양기에서 공기를 공급 하면서 균체를 배양시킬때 나오는 배출 공기속의 에칠 아세테이트는 향 포집 장치를 통과시켜 회수한 후 정량 분석 하였다. 배양액과 균체 효소 반응액 내의 에칠 아세테이트와 에탄올을 분석하기 위하여 직접 가스크로마토그라피에 주입하여 정량 하였으며, 이때 내부 표준 물질로서 아이소 프로판올을 사용하였다. 배양액 중에 생성된 휘발성분중 에탄올과 에칠 아세테이트가 가장 많았고 그 나머지는 초산, 노말 프로필 아세테이트, 그리고 아이소 부틸 아세테이트로 소량 발견 되었다. 균체의 성장과 함께 에칠 아세테이트의 생성은 증가 하였고, 주요 탄소원인 포도당과 알콜의 소모와 함께 에칠 아세테이트의 양도 감소되었다. 배양기에서 분리한 균체중 21 시간 경과된 균체가 가장 에스 터라제의 활성이 높았고, 균체내 에스터라제는 pH 7.0 과 30℃ 에서 가장 활성이 높은 것으로 나타났으며, 10℃에서 30℃ 사이에서의 활성 에너지는 25.9 Kcal/mole 이었다.
균체내 에스터라제는 0.1M 의 에칠 아세테이트를 서서히 가수분해하여 10 시간 후에는 29.8% 가 분해 되었으며, 이 효소는 10 mM -100 mM 이상의 에칠 아세테이트에 의한 기질 저해를 약간 받는 것으로 나타났다. 한편, 혐기적인 조건하에서 에탄올과 초산을 기질로 하여 에스터라제의 역반응에 의하여 에칠 아세테이트를 생성할 수 있었다.
