Thermolysin is a heat-stable endopeptidase isolated from $\underline{Bacillus}$ $\underline{thermoproteolyticus}$. The enzyme binds one zinc ion at the active site and four calcium ions at three distinct sites on the enzyme surface.
In this paper, we investigated the specificity of thermolysin for substrates, the effect of pH and temperature on the enzyme activity and the effect of calcium ios on the thermostability of the protein. In the study, degree of the enzyme reaction was measured by the spectrophotometrical ninhydin reaction method, and the thermal behavior of the enzyme was monitered spectrophotometrically by using the change of optical density of the enzyme solution according to the elivation of temperature which must be associated with the conformational change of the protein.
In the study on the substrate specificity, it was found that the $R_1$, side chain is a critical site and the peptide bond on the imino side of the bulky hydro phobic amino acid residue is effectively hydrolyzed, and also the hydrophobicity of the R1 side chain promotes the hydrolysis of the scissle peptide bond. The optimal pH range was between 7.0 and 7.5 and the pH profile was a bell-shape. The enzyme activity increased as temperature elivated from a low temperature (25℃) to 80℃. The activation energy was 4.4 kcal/mole at pH 7.5.
In the study on the effect of calcium ions on the thermal stability of the enzyme, the melting temperature(Tm) increased from 77℃ to about 90℃ as the calcium ion concentration increased from below $10^{-5}$M to $10^{-2}$M. And the Tm value decreased to about 50℃ in 10 mM EDTA, the metal ion chelating agent, solution, but in 2 mM phenanthroline, the chelating agent specific to the zinc ion, solution, the melting profile of the protein was same as in the solution of the low calcium ion concentration (below $10^{-5}$M).
Based on a series of these experiments it was proposed that the calcium ion binding to thermolysin is a critical factor on the thermal stability of the enzyme.
Thermolysin 은 Bacillus thermoproteolyticus 로 부터 추출한 열에 안정한 단백질 분해 효소이다. 이것은 펩타이드 사슬의 중간을 끊는다. 이 효소는 활성 부위에 한개의 아연 이온을 그리고 효소 표면 세 부위에 네개의 칼슘 이온을 부착하고 있다.
이 논문에서는 이 효소의 기질 특이성과 pH 와 온도가 효소 반응에 미치는 영향, 그리고 칼슘 이온이 이 효소의 열안정성에 미치는 영향을 연구하였다. 효소 반응의 정도는 광학적 닌하이드린 반응 방법에 의하여 측정하였으며, 이 효소의 열 반응 현상은 온도의 증가에 따른 효소 용액의 광밀도 변화(이 효소의 구조적 변화와 관련됨) 를 광학적 방법으로 측정함으로써 추적 하였다.
기질 특이성 연구에서 $R_1$ 측쇄가 결정적으로 중요한 부위 이며, 이곳에 커다란 소수성의 측쇄가 존재하면 이 측쇄의 소수성이 공격받는 펩타이드 결합을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 최적 pH 범위는 7.0 과 7.5 사이이며, 곡선은 종 모양이었다. 효소 활성도는 온도가 25℃ 에서 80℃ 까지 증가함에 따라 증가하였다. 효소 활성화 에너지는 pH 7.5 에서 4.4 Kcal/mole 이었다.
칼슘 이온이 이 효소의 열 안정성에 미치는 효과의 연구에서 용해 온도는 칼슘 이온의 농도가 $10^{-5}M$ 이하에서 $10^{-2}M$ 까지 증가함에 따라 77℃에서 약 $10^{-5}M$로 증가하였다. 또한 금속 이온 킬레이팅 물질인 EDTA 10 mM 용액에서 용해 온도는 약 50℃ 로 감소한 반면 아연 이온에 특이성을 가진 킬레이팅 물질 인 페난드롤린 2 mM 용액에서는 용해 온도가 77℃이며, $10^{-5}M$ 의 칼슘 이온 용액에서와 같은 용해 곡선을 나타내었다. 이러한 일련의 실험 결과로 부터 thermolysin 에 칼슘 이온이 부착하는 것은 이 효소의 열 안정성에 결정적으로 중요한 요인 이라고 주장하였다.
