As hepatitis B virus has a narrow host range $\underline{in vivo}$ and has not been propagated in cell culture, the application of recombinant DNA methods can, in principle, provide a limitless source of vaccine. One such vaccine, produced from the 22-nm particle form of hepatitis B surface antigen has been found effective in clinical tests. Hence, cloning and expression of only the hepatitis B surface antigen gene have been tried.
HBsAg gene was inserted into $\underline{E. coli}$ vector, pUL 2 and pUC 18 to examine the possibility of cloning and to express the gene. The pUL 2 vector(4.7 Kb) for HBsAg gene cloning was constructed by combining pUC 9, digested with HindIII enzyme, with Lambda DNA fragment(2.0 Kb) digested with HindIII enzyme. The vector now has a single restriction enzyme cleavage site for XbaI enzyme. The pUL 2 DNA was digested with XbaI enzyme and treated with BAP to inhibit the self-ligation.
The pUC 18 plasmid DNA was also digested with XbaI enzyme and treated with BAP. HBsAg gene fragment(1.8 Kb) derived from pHBV CB plasmid DNA digested with XbaI enzyme was ligated with the above two linear vectors by T4 DNA ligase. The ligated mixtures were used for the transformation in $\underline{E. coli}$. As a result of rapid isolation of plasmid DNA, recombinant (pULS, pUCS) were found each transformant and the orientation of the insert DNA was identified by restriction enzyme digestion of the recombinants in the correct direction for the expression of HBsAg gene.
B 형 간염 바이러스 전체 유전자를 포함하고 있는 pHBV CB 플라스미드(7,500 염기쌍)을 XbaI 제한효소로 자른 후, 나타나는 여러 부분들 가운데에서 간염 표면 항원 단백질을 작성하는 유전자를 포함하는 부분 (1,800 염기쌍) 만을 전기 영동 방법으로 분리해 냈다.
대장균 ($\underline{E. coli}$ HB101) 에서 pUC9 plasmid를 대량 분리하여 HindIII 제한효소로 자른후 pUC9 플라스미드 자체 사이의 재 봉합을 방지하기 위해 BAP 를 처리한 뒤, Lambda DNA를 HindIII 제한 효소로 자른 부분들 가운데 XbaI 제한효소의 인식 자리를 포함하고 있는 부분 (2,027 염기쌍) 을 전기 영동 방법으로 분리해 낸것과 T4 DNA ligase 로 연결해 대장균에 transformation 시키고 ampicillin 을 포함하는 LB 배지에 배양시켰다. 거기에서 자란 colony 를 조사해 재조합 플라스미드를 분리한 후 제한효소로 잘라 보아 확인하고 난 뒤 다시 XbaI 제한효소로 자르고 BAP를 처리해 자체 사이의 봉합을 막은 뒤 간염 표면 항원 유전자를 포함하는 부분과 연결시켜 다시 대장균에 transformation 시켰다. Ampicillin 을 포함하고 있는 LB 배지에서 자라는 colony 의 DNA를 조사하여 재조합 플라스미드 (6,500 염기쌍) 를 분리해 여러 제한 효소로 잘라 보아 insert DNA를 확인하고 그 방향을 결정하였다.
또 pUC18 플라스미드를 XbaI 제한효소로 자르고 BAP 를 처리한 후 간염 표면 항원 유전자를 포함하는 부분과 T4 DNA ligase로 연결시켜 대장균에 transformation시켰다. Ampicillin 을 포함하고 있는 LB 배지에서 성장하는 colony 를 조사해 재조합 플라스미드를 분리해 여러 제한효소로 잘라 보아 insert DNA 를 확인하고 그 insert DNA 의 방향을 결정하였다.
