The conditions for the production of interleukin-2(IL-2) from Jurkat-FHCRC cells were studied and poly($A^+$) RNA were extracted from Jurkat cells stimulated with ConA and TPA.
cDNAs were synthesized from the poly($A^+$) RNA by two different methods. First, the ss-cDNAs were synthesized using an oligonucleotide of complementary sequence to the 3'-end of the IL-2 gene as a primer. One prominant band sized about 500 base pairs was reproducibly observed on the denaturing polyacrylamide gel and this was consistent with the size determined from the known sequence of the IL-2 gene. Second, cDNA library was synthesized using oligo(dT) as a primer. $\underline{E.coli}$ JM 83 strain was used for transformation. Approximately 50,000 white, ampicillin-resistant colonies were obtained on 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranoside (X-gal)-ampicillin plate.
The insert sizes of cDNAs were ranged between 450 base pairs and 1,600 base pairs.
T-cell growth factor 라고도 하는 IL-2는 helper T-cells 이 macrophage 존재하에서 antigen 이나 유사분열촉진제로 활성화 될때 배출되는 antigen-nonspecific lymphokine이다.
인체 종양 세포인 Jurkat-FHCRC 세포의 IL-2 유도조건을 조사하기 위해 여러가지 조건에서 IL-2 활성을 조사했다.
IL-2 최고 활성은 세포 농도 $1\times10^6$cells/ml, 유사분열촉진제는 ConA(25ug/ml), TPA(5ng/ml)를 동시에 처리한 후 약 9시간 후에 나타났다. 그래서 poly($A^+$)RNA를 ConA(25ug/ml), TPA(5ug/ml)를 처리한 후 6시간 뒤 Jurkat-FHCRC 세포로부터 분리했다. $6.6\times10^9$세포로부터 231ug의 poly($A^+$)RNA를 얻었다. 그리고, 전체 RNA를 전기영동법으로 분해되지 않았다는 것을 확인하고, IL-2 유전자의 3'-끝에 상보적인 염기서열을 이용하여 ss-cDNA를 만들어 전기 영동을 하여 autoradiogram으로 IL-2 유전자와 같은 크기의 band를 확인하여 IL-2 유전자가 있음을 추정할 수 있었다.
Oligo(dT)를 primer로 사용하여 cDNA를 합성한 후 agarose gel 에서 450-2000 bp 까지 회수하여 dc-tailing 한 후 Pst I으로 자른 pUC 8 를 dG-tailing 하여, annealing 하였다. 이를 $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ JM83 strain 에 transformation 하여 ampicillin-X-gal plate 에서 흰 colonies 50,000개를 얻었다. 이들 흰 colonies 에서 임의로 뽑아 plasmid에 삽입된 cDNA의 크기를 조사한 결과 450-1.600 bp 였다.