Liposomes are biodegradable, non-toxic, and are used for intercellular delivery of proteins. However, the proteins are prone to degradation in organic solvents or dramatic temperature changes during the liposome preparation processes. In addition, controlling the size distribution of the liposomes incorporating the proteins is difficult, and the loading efficiency is only around 10 to 20 %, which is undesirable since proteins tend to be expensive. To solve these problems, I developed multi-lamellar formations using self-assembly by using the interactions between lipid membranes of the liposomes and polyelectrolytes in solution. Multi-lamellar complexes have been researched which protect intercalants from outer environment and exhibit dense alignment, inducing high loading efficiency of the intercalants. Because of the various charges of the lipids and the isoelectric points of the proteins, electrostatic attractions could be induced by the charge difference between the liposomes and the proteins. Here I demonstrated the formation of multi-lamellar complexes with membrane conformation of the cationic liposomes mediated by the anionic proteins in a layer-by-layer manner. DLS showed that the EGF/DOTAP complexes had narrower size distributions compared to the DOTAP liposomes. The dispersion stability of the EGF/DOTAP complex was retained for 100 days. The loading efficiency measured by BCA assay and ELISA were shown to be more than 95%. Molecular dynamics simulation was used to calculate the possibility of compact alignment of the EGFs on the DOTAP liposome membrane. FRET showed that the distance was 4 to 5 nm. To investigate the structure of the EGF/DOTAP complexes, the thicknesses of the DOTAP membranes and aqueous layer including the EGFs were calculated by cryo-TEM images. In addition, the mechanism of intercalation-aided formation of EGF/DOTAP complexes was investigated using Langmuir trough, which is used for analyzing the lipid surface changes by interactions between the lipid membrane and the proteins. Finally, the biological stability with structural and chemical changes of the EGF extracted from the complexes was shown to be more stable compared to the EGF in solution.
본 연구에서는 음이온성 EGF와 양이온성 DOTAP 리포좀 사이의 정전기적 인력을 통한 다층 라멜라 자기 조립 단백질/지질 복합체를 연구하였다. EGF/DOTAP 복합체는 DOTAP 리포좀 보다 작은150 $\pm$ 4.5 nm의 평균 지름을 가지고 DOTAP 리포좀 보다 균일하며, 100일 동안의 분산 안정성을 나타냈다. 또한, 다층 라멜라 구조를 가지고 있어, EGF가 DOTAP 지질 막 위에 매우 조밀하게 배열되어 높은 봉입 효율을 나타내는 것으로 보이며, 다층 막들이 보호막 역할을 하여 외부 환경으로부터 EGF의 생물학적 활성 유지를 돕는다. 그리고 EGF/DOTAP 복합체는 인산 나트륨 염 0.6 ~ 0.9 mM 농도와 상온 이하의 온도에서 안정하게 제조될 수 있다.
EGF/DOTAP 복합체의 구조는 MD simulation, FRET, cryo-TEM, 그리고 Langmuir trough 등으로 분석되었다. MD simulation과 FRET을 통해 EGF와 DOTAP 리포좀이 정전기적 인력으로 수 나노미터 이내로 접근해있다는 것을 알 수 있었으며, cryo-TEM을 통해 직접적으로 다층 라멜라 구조를 확인할 수 있었다. EGF/DOTAP 복합체 구조가 형성되는 메커니즘은 EGF의 유무에 따른 표면 압력의 감소를 통해 EGF가 DOTAP 리포좀 막의 외배엽과 내배엽 간의 불균형 및 리포좀의 변형을 유도하는 것으로 해석되었다.
EGF/DOTAP 복합체 내 EGF의 안정성은 ELISA, CD, 그리고 RP-HPLC를 통해 측정되었다. ELISA를 통해 수용액 내 EGF보다 복합체 내부에 봉입되어 있는 것이 생물학적 활성을 유지하는 것에 유리하게 나타났으며, CD와 RP-HPLC 분석을 통해 EGF의 구조적인 변화는 없었으며, 화학적인 변화가 나타나 이러한 변화가 생물학적 활성 감소를 유도했을 것으로 보인다.
그리고 EGF/DOTAP 복합체가 피부 흡수를 통해 EGF를 전달할 수 있는지를 동물 실험으로 확인하였다. 단순히 EGF를 처리했을 때 보다 복합체를 형성한 후 피부 내부의 EGF 수용체로 전달되는 EGF가 더 많은 것으로 나타났다.
