The development of the gene delivery vectors for the effective gene therapy have been studied for over 60 years. However, the viral vectors which were commonly used in the gene therapy field caused some safety problems such as immune response, pathogenic reaction and inflammation. To overcome the problems of the viral vectors, the non-viral vectors were de-veloped. As one class of the non-viral vectors, cell penetrating peptides (CPPs) have been used as a delivery tool because of their cell penetrating ability with low cytotoxicity. Although safety problems were solved using the CPPs as a gene delivery vector, the therapeutic effect was not good due to the low transfection efficiency. To maximize the therapeutic effect, we designed branched form CPPs which have high molecular weight and positive charge. In this study, a TAT (47 - 57) peptide which was derived from the HIV transactivator protein is com-posed of an 11-amino acid peptides (YGRKKRRQRRR) were used for gene delivery into HeLa cells. To make the branched form TAT, two TAT peptides were linked to each other by cysteine and then the N-terminus and S-terminus were modified by cysteine which has thiol group. After the synthesis of the modified TAT (mTAT), the branched TAT (BTAT) was syn-thesized by the DMSO oxidation reaction. For the gene delivery, BTAT was complexed with plasmid green fluorescence protein (pGFP) gene with various N/P ratios. The HeLa cells were treated with BTAT/pGFP complexes and the gene expression was observed by CLSM and FACS. As we expected, the transfection efficiency of BTAT/pGFP was about 40 times higher than TAT/pGFP and mTAT/pGFP. Therefore, the branched form TAT may act a powerful tool for cancer therapy and it can be applied to the other type of gene delivery systems.
본 연구의 목적은 높은 분자량과 강한 양성을 가진 그물망 형태의 유전자 전달체를 합성하여 암세포에 효과적인 유전자 전달을 목표로 한다.
유전자 치료는 질병을 치료하기 위해 약물 대신 유전자를 삽입하는 치료기술로써, 손상되었거나 비정상적인 유전자를 대신하여 정상적인 유전자를 삽입하는 방법과 질병 치료에 도움이 되는 유전자를 삽입하는 방법이 있다. 유전자 치료법은 일시적으로 증상을 완화시키는 약물 치료와 달리 특정 질환에 관련된 유전자를 억제하거나 바꿔줌으로써, 질환의 근본적인 원인을 제거할 수 있기 때문에 의학계의 지대한 관심을 받아왔다. 하지만, 다양한 유전자 치료제가 개발되었음에도 불구하고, 약물 전달체가 갖는 문제점 때문에 어려움을 겪고 있다.
약물 전달체는 크게 바이러스 전달체와 비바이러스 전달체로 나눌 수 있다. 바이러스 전달체는 레트로 바이러스의 게놈의 일부를 외부 유전자로 바꿀 수 있음이 밝혀지면서 사용되기 시작하였다. 레트로 바이러스 외에 아데노 바이러스, HSV 등 다양한 바이러스 전달체가 사용되었으나, 면역 반응, 염증반응유도, 병원성 회복 등 전달체에 의해 야기될 수 있는 잠재적 문제점들로 인해 많은 제약을 받고 있다. 이런 바이러스 전달체의 문제점을 피하기 위해 비바이러스 전달체가 개발되었다. 비바이러스 전달체는 면역 반응을 유도하지 않으며, 화학 합성을 통한 다양한 응용이 가능하다는 장점이 있으나, 바이러스 전달체에 비해 유전자의 전달 효율이 매우 낮아 질병 치료제로서의 개발에 큰 장애가 되고 있다.
본 연구에서 제안한 세포 투과성 펩타이드를 이용한 그물형 전달체는 독성이 없는 세포 투과성 펩타이드를 그물형태로 이어줌으로써, 높은 분자량과 양성을 갖게 되어 기존의 전달체들이 갖는 면역반응과 낮은 효율 문제를 개선하기 위해 디자인 되었다. 그물형 전달체의 합성은 DMSO 산화 반응을 통해 이뤄졌고, 젤 형태의 확인 및 분자량과 CD 측정을 통해 그물형 전달체가 합성됐음을 확인하였다. 또한, 전달체와 유전자의 나노 입자 형성을 전기 영동으로 확인하였고, 사이즈와 zeta-potential을 측정함으로써 물질 전달에 적합함을 확인하였다. 세포 내 입자의 분해 여부를 알기 위해 GSH를 처리하였고, 전기영동과 입자의 크기 변화를 시간 별로 관찰하여 확인하였다. 암세포 내 트랜스펙션은 형광 현미경과 공초점 레이저 주사현미경을 이용해 세포 내 유전자 발현을 확인하였다. 정량 분석을 위해 유세포 분석 장치 (FACS)를 이용하였고, 흐름 분석 결과를 통해 세포 내 트랜스펙션 정도를 정량적으로 비교하였다. 위의 자료들을 바탕으로 그물 형태 세포 투과성 펩타이드와 유전자를 결합시킨 나노 입자가 기존의 세포 투과성 펩타이드보다 높은 트랜스펙션 효율을 보임을 확인하였다.
본 연구에서 제안한 그물 형태 세포 투과성 펩타이드는 세포 독성을 낮추며 높은 분자량과 양성을 띄어, 효과적인 트랜스펙션이 가능함을 보여주었다. 끝으로, 그물형 세포 투과성 펩타이드는 효과적인 유전자 치료를 위해 적합한 전달체라 생각된다.
