Trans-cinnamic acid is one of phenylpropanoid having many applications as precursors for cosmetics, flavoring compounds, anti-bacterial compounds, and pharmaceuticals. Trans-cinnamic acid has conventionally produced by extraction from plant sources or chemical synthesis. However, several shortcomings have been existed in conventional methods such as low concentration in plant source or the toxic byproduct generation. Therefore, in recent decades, trans-cinnamic acid production using metabolically engineered microbes has emerged as a powerful alternative method.
The main goal of this thesis was to expand the capability and improve the ability of microbial biosynthesis of trans-cinnamic acid in Escherichia coli through systems level metabolic engineering strategies. First, I developed the genetically engineered E. coli which can efficiently produce L-phenylalanine (main precursor of trans-cinnamic acid) through strain engineering and plasmid based overexpression of L-phenylalanine biosynthesis pathway genes. After that, I built a biosynthetic pathway for trans-cinnamic acid by introduction of heterologous enzyme, phenylalanine-ammonia lyase, in engineered E. coli. I also optimized the culture condition for enhanced production of L-phenylalanine and trans-cinnamic acid. Lastly, the fed-batch fermentation of trans-cinnamic acid and even L-phenylalanine also carried out to see if the production performance (titer, yield, productivity) of engineered E. coli is suitable for economically industrial production or not.
As a result of native pathway engineering for L-phenylalanine target and introduction of heterologous enzyme for trans-cinnamic acid production, engineered E. coli YHP05 harboring pYHP plasmid and YHP05 harboring pYHP and pCA plasmids were developed, respectively. In flask and fed-batch cultivation of YHP05 harboring pYHP plasmid, the recombinant E. coli YHP05 harboring pYHP plasmid showed good production performance compared to parental host as well as other L-phenylalanine overproducing strains. The L-phenylalanine production titer reached up to 3.91 g/L with yield of 0.270 g/g glucose and productivity of 0.082 g/L/h in flask cultivation. And the maximum L-phenylalanine titer was 52.89 g/L with yield of 0.248 g/g glucose and productivity of 1.102g/L/h in fed-batch fermentation. In case of trans-cinnamic acid production in flask and fed-batch cultivation, the recombinant E. coli YHP05 harboring pYHP and pCA plasmids also showed good production performance compared to parental host as well as other trans-cinnamic acid overproducing strains. The trans-cinnamic acid production titer reached up to 413 mg/L with productivity of 8.6 mg/L/h in flask cultivation. And the maximum trans-cinnamic acid titer was 4.1 g/L with yield of 0.072 g/g glucose and productivity of 0.057 g/L/h in fed-batch fermentation.
To the best of my knowledge, this is the first report of development the microbial cell factory for production of trans-cinnamic acid based on systems level metabolic engineering approach. Moreover, the trans-cinnamic acid titer achieved in this study is 5.13-fold higher than the reported highest titer ever in trans-cinnamic acid production. This work will significantly contribute to the field of microbial trans-cinnamic acid production and developed microbial cell factory in this study can be economically feasible production platform in the future. Moreover, the systems level metabolic engineering strategies described in this study can make the other microbes be from zero to hero strain in trans-cinnamic acid production and even more other phenylpropanoids production.
계피산 (trans-cinnamic acid) 은 화장품, 향료, 살균제, 의약품 등의 전구체로 사용될 수 있는 페닐프로파노이드 중의 하나이다. 계피산은 전통적으로 식물에서의 추출이나 화학 합성으로 생산되어 왔으나 낮은 추출 농도, 유독성의 부산물 생성 등의 단점이 있었다. 그러므로 최근에는 대사적으로 조작된 미생물을 이용한 계피산 생산이 효과적인 대안으로 떠오르고 있다.
본 연구의 목적은 시스템 수준 대사 공학을 기반으로 하여 계피산을 효율적으로 생합성 할 수 있는 대장균을 만드는 것이다. 이를 위해 먼저 유전자 조작을 통한 균주 개량으로 계피산의 주요 전구체인 페닐알라닌을 효율적으로 생산할 수 있는 대장균주를 구축했다. 그 후 이종 유래의 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 앞서 조작된 대장균주에 도입함으로써 계피산 생합성 경로를 구축하였다. 또한 배양 조건을 최적화 하고, 개발된 대장균주가 산업적으로 경제적인 생산을 할 수 있는지 알아보기 위해 유가 배양식 발효로 생산능력을 알아보았다.
페닐알라닌 생합성 경로 조작과 계피산 생합성을 위한 효소 도입을 통해, 페닐알라닌 생산 균주(YHP05/pYHP)와 계피산 생산 균주(YHP05/pYHP&pCA)가 개발 되었다. 두 균주 모두 플라스크 배양 및 유가 배양식 발효에서 야생형 균주 뿐만 아니라 기존의 생산 균주들보다도 좋은 생산 능력을 보여주었다. 페닐알라닌 생산 균주의 경우 플라스크 배양에서 3.91 g/L의 최종 농도, 0.270 g/g의 수율, 0.082 g/L/h의 생산성을 보였으며, 유가 배양식 발효에서 52.89 g/L의 최종 농도, 0.248 g/g의 수율, 1.102 g/L/h를 보였다. 52.89 g/L의 생산량은 현재까지 보고 된 조건 최적화 없이 유가 배양식 발효를 통해 얻은 최고 생산량 (47 g/L) 보다 높은 수준이다. 계피산 생산 균주의 경우 플라스크 배양에서 413 mg/L의 최종 농도, 8.6 mg/L/h의 생산성을 보였고, 유가 배양식 발효에서 4.1 g/L의 최종 농도, 0.072 g/g의 수율, 0.057 g/L/h의 생산성을 보였다.
이제까지 시스템 수준의 대사 공학을 이용하여 계피산을 생합성 할 수 있는 미생물 세포 공장을 만든 연구는 없었다. 또한 본 연구에서 달성한 4.1 g/L의 계피산 생산량은 현재까지 보고 된 계피산 최고 생산량 (0.8 g/L) 보다 약 5.13배 높은 수준이다. 본 연구는 미생물을 이용한 계피산 생산 분야에 큰 기여를 할 것이며, 또한 본 연구에서 개발 된 계피산 생산 균주가 미래에는 산업적으로 경제적인 계피산 생산이 가능한 플랫폼이 될 수도 있을 것이다. 게다가 본 연구에서 적용한 시스템 수준의 대사공학 기법을 이용한다면 대장균이 아닌 다른 미생물들도 계피산이나 유용한 페닐프로파노이드 생산에 적합한 균주로 개량 될 수 있을 것이다.
