Staphylococcus aureus Sortase A, the trans-peptidase which ligate the protein to the gram-positive cell wall is widely used for the post-translational protein ligation. It has been highlighted due to its site-specific catalytic activity with short target motif. However Staphylococcus aureus sortase A is highly depends on the existence of $Ca^{2+}$ ion, therefore it is hard to utilize sortase A in vivo. To over-come this problem, I have developed high throughput screening system to isolate $Ca^{2+}$ independent SrtA mutant in Escherichia coli based on the tripartite split green fluorescent protein (GFP) system. Reassembly of tripartite split GFP catalyzed by $Ca^{2+}$ independent sortase A could be detected by high speed fluorescence activated cell sorter (FACS). After several round sorting, I found and characterized $Ca^{2+}$ independent sortase A mutant which had different mutation point with rationally engineered sort-ase A. The catalytic activity also validated using in vitro and in vivo analysis with several types of sub-strate. This research is not only an easy system of enzyme engineering, but also the first engineering application of tripartite split GFP system.
다양한 기능을 가진 키메릭 단백질의 경우 단백질 공학의 많은 분야에서 활용이 가능하다. 하지만 이를 생산하기 위한 유전자 조작을 이용한 단백질 융합 기술의 경우, 각 단백질의 발현량이나 기능, 구조 등이 현저히 달라지는 여러 경우에 있어 어려움을 겪는다. 따라서 각각의 융합 파트너 단백질을 독립적으로 최적의 상황에서 생산한 후 연결하는 번역 후 단백질 융합 기술은 중요하게 이 방식이기 때문에, 보다 다양한 분야의 단백질 공학에 이용할 수 있다. 그러나 번역 후 단백질 융합을 위한 효소 및 화학 물질의 경우 그 특이성이 낮거나 결합을 위해 커다란 단백질 조각이 추가적으로 필요한 경우가 많아 기술적인 어려움이 있다.
황색 포도상구균에서 유래한 전이효소 솔테이즈 에이는 그람 양성균 세포벽에 단백질을 공유결합 시킬 때 이용되는 효소로, 아미노산 서열 중 LPXTG 를 인식해 트레오닌과 글라이신 사이 결합을 끊어 아실효소 중간체를 만들고, 세포벽 N말단의 올리고글라이신 모티프와 공유결합을 만들어 두 단백질 사이에 LPXTGn 결합을 만드는 역할을 한다. 이 효소는 다른 번역 후 단백질 융합 효소에 비해 자리특이성이 높고, 짧은 펩타이드 결합만 요구하기 때문에 다양한 단백질 융합 과정에 이용되고 있다. 솔테이즈 에이는 또한 온도 및 pH 범위 역시 안정적이지만, 칼슘 이온의 존재 아래에서만 효소 기능이 활발하기 때문에 대장균 등의 세포질 내에서 사용하기에는 어려움이 있다.
이러한 솔테이즈 에이의 높은 칼슘 이온 의존성을 개선해 세포질 내 활용도를 높이기 위해, 본 논문에서는 무작위 돌연변이와 형광 기반 유세포 분석기를 이용한 고효율 발굴을 통해 칼슘 비의존성 솔테이즈 에이를 개발하였다. 특별히 세 조각 (GFP1-9 OPT, GFP10-LPETG. GFP11-GGGG) 스플릿 녹색 형광 단백질 시스템을 솔테이즈 에이의 기질로 개량하여 효소 작용에 의한 각 GFP 조각의 상보 결합을 형광 기반 스크리닝에 활용하는 전략을 구축하였다.
이 시스템을 기반으로 무작위 라이브러리 발굴을 진행한 결과, 칼슘 비의존성을 가진 돌연변이를 찾아내었고 아미노산 서열 분석 및 다양한 기질을 이용한 효소 활성 분석을 통해 최적의 칼슘 비의존성을 가진 솔테이즈 에이를 개량하였다. 본 논문에서 개량한 칼슘 비의존 솔테이즈 에이는 앞으로 항체 조각 연결, 효소 연쇄 반응, 원형질 막 공간에서의 효소 연결 등 다양한 세포 내에서의 번역 후 단백질 결합 과정에 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 세 조각 스플릿 녹색형광단백질 시스템을 기반으로 한 고효율 형광 스크리닝 기술 역시, 다른 종류의 효소 개량에도 효율적으로 이용할 수 있을 것이다.
