Leuconostoc is a hetero-fermentative lactic acid bacteria, and its importance is widely recognized in the dairy industry. However, due to limited genetic tools including plasmids for Leuconostoc, there has not been much extensive research on the genetics and engineering of Leuconostoc yet. Thus, there is a big demand for high-copy-number plasmids for useful gene manipulation and overproduction of recombinant proteins in Leuconostoc.
Using an existing low-copy plasmid, the copy number of plasmid was increased by random muta-genesis followed by FACS-based high-throughput screening. First, a random library of plasmids was con-structed by randomizing the region responsible for replication in Leuconostoc citreum; additionally, a su-perfolder green fluorescent protein (sfGFP) was used as a reporter protein. With a high-speed FACS sorter, highly fluorescent cells were enriched, and after two rounds of sorting, single clone exhibiting the highest level of sfGFP was isolated. The copy number of the isolated plasmid (pCB4270) was determined by quan-titative PCR (qPCR). It was found that the isolated plasmid has approximately a 30-fold higher copy num-ber (approx. 70 copies per cell) than that of the original plasmid. From the sequence analysis, a single mu-tation (C T) at position 4690 was found, and we confirmed that this single mutation was responsible for the increased plasmid copy number. The effectiveness of the isolated high-copy-number plasmid for the overproduction of recombinant proteins was successfully demonstrated with two protein models Glutathi-one-S-transferase (GST) and α -amylase.
In couclusion, the high-copy number plasmid was successfully isolated by FACS-based high-throughput screening of a plasmid library in L. citreum. The isolated plasmid could be a useful genetic tool for high-level gene expression in Leuconostoc, and for extending the applications of this useful bacteria to various areas in the dairy and pharmaceutical industries.
유산균 (Lactic acid bacteria, LAB) 은 그람 양성균에 속하는 균주로, Lactococcus, Lacto-bacillus, Leuconostoc, Pediococcus 그리고 Sereptococcus 종이 대표적으로 알려져 있다. 유산균은 주로 당을 젖산으로 발효하는 기능을 가지며, 다양한 발효 식품과 음료, 동물의 사료 등의 산업적 생산에 유용하게 이용된다. 최근에는 probiotics로 선정되어 건강을 증진하는 효과를 입증 받았다. 이러한 산업적 중요성 외에도, 현재 유산균은 균주가 가지는 안전성 덕분에 고부가 가치 화합물 및 단백질을 생산할 유망한 균주로 촉망받고 있다. 유산균은 그람 음성균과 달리 독성이 없고 인체에 무해하여 GRAS (Generally recognized as safe)로 승인 받았으며, 지난 몇 십 년간 유산균을 재조합 미생물 공장으로 이용하기 위한 많은 연구들이 진행되어 왔다. 유산균은 안전한 특성 이외에도 단백질의 분비생산이 용이하여 단백질 정제를 간편하고 경제적으로 할 수 있다. 또한 Bacillus subtilis와 같은 대표적 그람 양성균 호스트와 비교하였을 때, 세포 외 housekeeping protease가 거의 없어 대부분의 외래 단백질이 분해되지 않고 분비된다는 장점을 가진다.
류코노스톡은 이종 발효를 하는 유산균의 일종으로, 특히 식품 산업에서 매우 중요한 균주로 이용되고 있다. 류코노스톡 종에 대한 연구는 아직 시작 단계이며, 류코노스톡 종을 이용하여 다양한 생산물을 얻기 위해서는 기본적으로 적합한 유전자 발현 및 조작 시스템이 필요하다. 그 중 플라스미드는 목표물질의 DNA를 세포 내부로 운반하는 벡터 역할로 주로 사용되며, 재조합 유전자 조작과 단백질 발현을 위한 기본이 되는 것으로, 적합한 플라스미드 시스템의 구축이 필수적이다. 기존에 개발된 류코노스톡 발현용 플라스미드는 복제수가 낮아 단백질의 고생산에 적합하지 않았다. 따라서 산업적으로 유용한 류코노스톡을 숙주 세포로 이용하여 유전학적 연구를 진행하기 위해서는 고복제수 플라스미드의 개발이 시급하다.
따라서 본 학위 논문에서는 류코노스톡에서 효율적인 재조합 단백질의 생산을 위해 고복제수 플라스미드를 개발하기 위한 연구를 진행하였다. 먼저, 플라스미드의 개량을 위해 기존의 저복제수 류코노스톡-대장균 셔틀 벡터를 기반으로 복제에 관련된 서열에 대해 error-prone PCR 방법을 통해 무작위적 돌연변이를 유발하였으며, 녹색 형광 단백질을 증가된 복제수를 확인하기 위한 리포터 유전자로 연결하였다. 위 돌연변이를 가지는 플라스미드를 함유하는 류코노스톡 시트리움 라이브러리를 구축하였고, 형광 세포 활성 분류기를 통해 높은 형광 값을 가지는 세포들이 분리되었다. 최종적으로 가장 형광 세기가 높았던 한 종류의 플라스미드를 함유하는 세포가 발굴되었고, 플라스미드 염기 서열의 한 부분에서 돌연변이가 발생함을 확인하였다. 발굴한 플라스미드의 분석 결과, 기존 대비 30배 가량 증가한 70카피 정도의 높은 복제수를 가지는 류코노스톡-대장균 셔틀 벡터를 얻었음을 확인하였다. 리포터 유전자로 발현한 녹색 형광 단백질 외에 다른 재조합 단백질 모델인 글루타치온-S-전이효소와 알파-아밀라아제를 각각 세포 내, 외에서 기존 플라스미드 대비 과발현 하는 데에 성공하였으며, 발굴한 플라스미드의 범용적 유용성을 입증하였다.
결론적으로, 본 논문에서는 류코노스톡 기반의 재조합 단백질의 효율적인 생산을 위한 고복제수 플라스미드를 유세포 형광 활성 세포 분류기를 기반으로 발굴하였다. 위의 발굴한 고복제수 플라스미드는 류코노스톡에서 유용한 유전자 재조합 도구로써 이용될 수 있을 것이다. 또한, 유산균주에서 라이브러리를 구축하여 유세포 형광 활성 세포 분류기를 이용한 스크리닝에 대한 첫 연구라는 점에서 그 중요성이 높다.
