This study focuses on the cloning, expression, and characterization of a recombinant ginsenoside hy-drolyzing glycosidase from Novosphingobium aromaticivorans KCTC $2888^{T}$ in order to efficiently biotransform protopanaxadiol type major ginsenosides ($Rb_1$, $Rb_2$, Rc, Rd) into ginsenoside $F_2$. The gene (BglNar) consists of 1,320 bp (439 amino acid residues) and revealed significant homology to that of glycoside hydrolase family 1. The gene was cloned and the recombinant enzyme overexpressed in Escherichia coli BL21(DE3) using a GST-fused pGEX 4T-1 vector system was characterized at conditions of pH 6.0 and $37^\circ C$. BglNar could convert gin-senosides $Rb_1$, $Rb_2, Rc$ into $F_2$ via Rd or gypenoside XVII, Rd, $C-Mc_1$, respectively, through selective hydrolysis of the glucose or arabinosides moieties. $K_m$ value of p-nitrophenyl- $\beta$ -D-glucopyranoside was 6.73 $\pm$ 0.27 and the $V_{max}$ value was 21.2 $\pm$ 0.36 $\mu mol min^{-1} mg^{-1}$ of protein, respectively. A crude protopanaxadiol-type ginsenoside mixture (PPDGM) was treated with BglNar followed by a column purification packed with HP20 resin, to pro-duce $F_2$ at chromatographic purities of 82.5 $\pm$ 1.3%. This is the first report of gram-scale production of $F_2$ from PPDGM using a novel ginsenoside-transforming $\beta$ -glucosidase of glycoside hydrolase family 1.
인삼의 주된 활성 성분인 진세노사이드는 항암, 항염증, 항산화, 항노화 등 다양한 생물학적, 약리학적 효과를 보인다. 진세노사이드는 구조적으로는 아글리콘의 생김새에 따라서는 PPD, PPT, oleanane 류로 나뉘고, 성분비에 따라서는 한국과 미국 인삼의 전체 진세노사이드 중 80% 이상을 차지하는 주 진세노사이드, 그리고 그 주 진세노사이드의 당이 제거된 형태로 더 작은 크기이고, 전체 진세노사이드 중 20% 미만을 차지하는 부 진세노사이드로 나뉜다. 인체의 소화 기관에서 주 진세노사이드는 그 크기, 낮은 용해도, 낮은 투과력으로 인해 흡수가 쉽지 않기 때문에 주 진세노사이드의 부 진세노사이드로의 전환을 통해 생리학적 활성을 가진 형태로 만들어 주는 것이 필요하다. 여러 전환 방법 중 효소를 이용한 방법이 적은 부산물, 더 좋은 특이성 등의 장점을 제공하기에 가장 효과적일 것으로 기대되며, 특히 재조합 효소는 미생물에서 추출, 정제한 순수 효소보다 더 좋은 선택성과 효율을 보인다.
본 연구에서는 PPD류 부 진세노사이드 $F_2$ 를 얻기 위해 Novosphingobium aro-maticivorans KCTC $2888^{T}$ 에서 유래한 진세노사이드 글리코시드 가수분해 효소 BglNar을 이용하여 재조합 효소를 클로닝, 발현, 특징화하였다. BglNar 유전자는 1,320 bp크기로 글리코시드 가수분해효소 1 (GH1)족과 주목할 만한 상동관계를 보였고, GST를 붙여서 재조합 효소로 발현시킨 결과 pH 6과 $37^\circ C$ C에서 좋은 활성을 나타냈다. DTT, $\beta -mercaptoethanol$ 은 효소 활성에 의미 있는 영향을 주지 않았고, $Ca^{2+}$ 는 효소 활성을 촉진, $Cu^{2+}$, $Hg^{2+}$ 는 억제하였다. EDTA와 SDS는 BglNar의 활성을 크게 억제하였다. $p-nitrophenyl-\beta -D-glucopyranoside (PNPGlc)$ 를 가수분해할 때 BglNar의 $K_m$ 과 $V_max$ 값은 각각 6.73 $\pm$ 0.27 mM, 21.2 $\pm$ 0.36 $\mu mol min^{-1} mg^{-1}$ (단백질) 이었다.
재조합 BglNar로 2g의 PPD류 진세노사이드 혼합물을 가수분해하여 생물전환시킨 후 HP20 수지가 장착된 컬럼에 정제했을 때 82.5$\pm$ 1.3% 순도로 1.14g의 진세노사이드 $F_2$ 를 얻었고, 이것은 GH1족의 새로운 $\bete$ 글리코시드 가수분해 효소를 이용하여 PPD류 진세노사이드 혼합물로부터 $F_2$ 를 g단위로 생산한 첫 번째 사례이다.
