High fat diet (HFD)-induced obesity (DIO) accompanies inflammatory responses in the adipose tissue, where myeloid-derived macrophage plays a central role. Recent study has demonstrated that microglia, the resident macrophage in the central nervous system, are activated in the hypothalamus of mice with DIO. However, the contribution of myeloid-derived macrophage in obesity-associated hypothalamic inflammation remains unclear. During my PhD course, I investigated the role of macrophage in the development of hypothalamic inflammation and metabolic complications in DIO mice. In lean mice, macrophage was found in the median eminence, hypothalamic perivascular space and meninges surrounding the hypothalamus. HFD significantly induced activation and infiltration of macrophage in the parenchyma of hypothalamic arcuate nucleus (ARC). Most hypothalamic macrophages express the microglial marker Iba1, indicating that they may differentiate to microglia. Parabiosis experiment failed to demonstrate recruitment of monocytes to the hypothalamus in both lean and DIO mice. Ki67 immunohistochemistry revealed increased local proliferation of the perivascular and meningeal macrophage in DIO mice. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression was increased in the mediobasal hypothalamus and hypothalamic macrophage of DIO mice. Blockade of hypothalamic NOS significantly inhibited hypothalamic macrophage activation but no effect on resident microglia. Furthermore, hypothalamic NOS inhibition in DIO mice ameliorated leptin resistance and reduced enhanced proinflammatory cytokine expression. In summary, myeloid ？derived macrophage is activated in the hypothalamic ARC of obese mice and causes hypothalamic inflammation and leptin resistance via iNOS-dependent mechanisms.
비만은 서구 사회를 중심으로 일어나는 가장 흔한 대사 질환 중에 하나로 알려져 있다. 미국의 예로, 전체 성인 인구의 30% 이상이 비만이며, 이는 현재까지도 증가하는 추세에 있다. 비만은 제 2형 당뇨병, 동맥경화, 심장 질환, 그리고 이를 비롯한 다양한 합병증의 원인이 되며, 장기적으로 신체에 전반적으로 지속되는 염증상태로 정의된다. 이러한 염증반응은 중추신경계와 말초신경계에서 인슐린, 렙틴과 같은 호르몬 저항성과 대사 불균형을 초래하고 나아가 조직 손상을 초래하게 된다. 이러한 위험성에도 불구하고 수많은 비만 관련 연구가 보고되어 왔지만 효과적인 치료제는 아직 개발되지 않았다.
비만증에서 증가되는 IL-1β, IL-6 그리고 TNFα와 같은 염증성 사이토카인 (cytokine)들은 지방조직, 근육, 또는 간에서 인슐린과 렙틴 신호전달체계를 저해한다. 이러한 현상은 말초조직뿐만 아니라 중추 신경계에서도 일어나는데, 특히 시상하부에서 특이적으로 염증성 사이토카인이 증가된 것이 보고되었다. 시상하부는 전뇌의 하단부에 위치하며, 뇌하수체를 통해 말초로 호르몬을 분비하는 기능을 한다. 시상하부에는 식욕과 대사를 조절하는데 관여하는 신경세포들이 존재하는데, 대표적으로는 POMC와 AgRP 뉴런이 있다. 간략히, POMC 뉴런은 식욕을 낮추며 기초대사를 올리는 역할을 하며, AgRP 뉴런은 식욕을 올리며 기초대사를 낮추는 역할을 한다. IL-1β, IL-6 그리고 TNFα와 같은 염증성 사이토카인은 이러한 시상하부에서 인슐린과 렙틴에 저항성을 일으키고, 지속적인 대사 불균형을 초래한다.
염증성 사이토카인을 분비하는 염증 세포는 B세포, T세포, NK세포, 그리고 대식세포 등이 있으며, 특히 대식세포는 조혈모세포로부터 기원한 단핵구에서 분화되어 조직으로 침투해, 강력한 호르몬 저항성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 대식세포는 침투한 조직의 종류에 따라 Alveolar macrophage, Histiocyte, Intestinal macrophage, Osteoclast, Kupffer cell 그리고 Microglia 등으로 다양하게 불린다. 이들은 정상상태에서는 항원을 인식하여 대식작용을 하거나 항원표지자로서의 역할을 수행하지만, 체내 항상성이 무너지면 염증반응을 일으켜, 주변 조직의 기능을 저해할 수 있다.
위에 언급한 바와 같이 현재까지 microglia는 중추신경계에 존재하며 혈액 내 단핵구에서 유래한 조직 대식세포 중 하나로 잘 알려져 있다. 비만증에서 microglia는 시상하부 특이적으로 활성화가 되며 그 수적 증가를 보여주는데, 이는 시상하부 조직 내의 IL-1β, IL-6 그리고 TNFα와 같은 염증성 사이토카인의 증가와 함께 관찰된다. 비만증뿐만 아니라 microglia의 수적 증가가 관찰되는 다른 중추신경계 질환에서도 마찬가지로 염증성 사이토카인의 발현이 동반되는 양상을 보였다.
하지만 최근 연구에서 중추신경계 내의 microglia는 다른 조직의 대식세포와 그 기원과 역할이 다르다는 것이 보고됨에 따라 각종 염증 질환에 있어, 이 세포들을 구분한 연구가 이루어지는 추세이다. 최근 이루어지고 있는 연구 결과에 따르면 중추신경계 내에 존재하는 microglia는 혈액 내의 단핵구에서 기원한 말초조직의 대식세포와 달리, 난황낭(Yolk sac)에서 유래한 골수전구세포로부터 기원하였다. 발생과정에서 이 세포는 신경세포의 발달 과정에 합류하고, 혈관-뇌 장벽이 형성됨에 따라 말초 염증세포를 비롯한 다양한 물질들로부터 차단된다. 특히 골수로부터 유래한 단핵구들은 비만증과 같은 염증 상태에서 조직으로 침윤되어 강력한 염증성 사이토카인을 분비함으로써 대사 불균형을 초래하는 것으로 알려져 있기 때문에, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증과 같은 중추신경계 염증 질환에서 골수 유래 세포들이 침윤되는지의 여부에 대한 관심이 최근 급증하고 있다. 하지만 많은 연구들이 어떠한 실험 방법으로 그것을 증명하는지에 따라 상반된 결과를 보여줌으로 인해 현재까지 골수 유래 세포들이 중추신경계로 침윤되는지의 여부는 논란 중에 있다. 한 예로, 형광표지를 한 골수 유래 세포를 중추신경계 질환 동물에 이식하는 과정에서 수혈동물이 방사선을 쬐게 되는데, 방사선에 의해 혈관-뇌 장벽의 파괴된다는 보고를 근거로 실험 과정에서의 부작용으로 논란이 된 바 있다.
이러한 논란을 피하기 위해 골수 유래 세포에 LysM을 발현하는 세포에만 선택적으로 cre-recombinase를 발현하는 동물과 cre-recombinase를 발현하는 세포에서 lox-P site중간에 위치하는 STOP sequence가 잘리면 GFP를 발현하는 동물을 교배하여, 골수 유래 세포 특이적으로 GFP를 발현하는 동물 모델 (LysM/GFP 마우스)을 제작하였다. 비만증에서 골수 유래 세포의 침윤을 확인해 보기 위해 7주령의 LysM/GFP 동물에 chow diet (CD)와 high fat diet (HFD)를 각각 제공하였다. 몸무게는 고지방식이를 시작한지 4주 정도 되었을 때 일반식이를 한 동물에 비해 유의한 차이를 보이기 시작하여, 약 20주간 고지방식이를 하면 steady-state한 비만 몸무게를 보여준다. 몸무게가 분리되는 4주와, 만성 비만상태인 20주간 고지방식이를 한 동물, 그리고 같은 주령의 일반식이 동물 에서 뇌 조직을 얻어 골수 유래 세포를 비교해 본 결과, 시상하부의 궁상핵 (Arcuate nucleus, ARC) 주변에 골수 유래 대식세포가 크게 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 한편 일반식이 동물에서는 혈관-뇌 장벽이 없는 median eminence (ME) 부분과 ARC 일부에만 존재한다.
증가한 세포의 특성을 확인해 보기 위해 microglia의 지표인 Iba1과 GFP의 공동염색을 수행하였다. 그 결과, 대부분의 골수 유래 대식세포가 microglial 마커를 함께 발현하는 것으로 나타났으며, 이는 골수 유래 세포가 resident한 microglia로 분화가 될 수 있음을 시사한다. 항원 지표뿐만 아니라, 그 위치와 형태로도 세포를 구분할 수 있었다. 크게 혈관 주변의 perivascular area에 존재하는 perivascular macrophage, 뇌 조직의 parenchymal area에 존재하는 parenchymal macrophage로 나누어볼 수 있었다. 대부분의 parenchymal macrophage는 고지방식이군의 동물에서 관찰되었으며, perivascular macrophage는 일반식이 동물에서도 관찰되었다. 흥미롭게도 일반식이 동물의 혈관 주변에서 작은 크기로 관찰되었던 perivascular macrophage는 고지방식이에 의해 그 크기가 커지고, 길이가 연장되고 또한 일부는 parenchymal macrophage로 이동하는 것으로 보여졌다.
말초 조직에서 골수 유래 세포의 침윤은 침투성 혈관을 통해 이루어진다. 같은 원리로 시상하부의 혈관 침투성을 확인해 보기 위해 MECA-32, Evans blue 그리고 fluorescence-conjugated albumin을 이용하였다. 우선 MECA-32는 혈관-뇌 장벽을 제외한 침투성 혈관에서 발현하는 단백질로, 중추신경계의 혈관 침투성 연구에 있어 주로 사용된다. 시상하부에서 MECA-32는 median eminence의 basal area에서만 주로 관찰되나, 고지방식이를 한 동물에서는 시상하부 궁상핵 주변부로 MECA-32를 발현하는 혈관이 확장되어 있는 것을 확인할 수 있었다. Evans blue는 혈관을 타고 이동하며, 침투성 혈관을 통해 조직으로 확산된다. 시상하부의 경우 Evans blue는 혈관-뇌 장벽이 없는 median eminence와 혈관 내부에서만 관찰되며 고지방식이 동물의 시상하부에서는 궁상핵 부위에 Evans blue가 침윤되어 있는 것을 확인하였고, optical density 측정을 통해서도 이를 재확인하였다. Albumin은 혈액 내에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로, 형광표지자를 연결한 albumin을 주입함으로써, 혈관 침투성을 확인해볼 수 있다. 그 결과 형광표지자를 단 albumin이 고지방식이 동물 시상하부의 혈관 주변부에 관찰되었으며, 일반식이 동물의 경우 거의 관찰되지 않았다.
이러한 혈관 침투성 증가가 혈액 내에 존재하는 골수 유래 세포의 침윤에 직접적인 영향을 미치는지 확인해 보기 위해 parabiosis를 수행하였다. LysM/GFP 동물은 donor mouse, C57BL/6 동물은 recipient mouse로 사용하였고, FACS analysis를 통해 혈관이 성공적으로 개통되었는지 확인하였다. 개통 확인 이후, 성공한 동물 쌍을 일반식이와 고지방식이를 나누어 6주간 먹인 후, 각각의 동물의 시상하부에서 GFP가 표지된 대식세포를 분석해 보았다. 그 결과 LysM/GFP 동물의 시상하부에서 관찰된 GFP 표지세포는 recipient C57BL/6 동물에서 관찰되지 않았다. 이 결과는 혈액 내의 단핵구가 고지방식이를 하더라도 시상하부로 침윤되지 않는다는 것을 의미하지만 고지방식이 과정에서 수술 후 불편함으로 인해 먹이 섭취량이 크게 감소했음을 고려하여, 고지방식이를 먼저 수행한 후 parabiosis 수술을 수행하였다. 6주간 일반식이와 고지방식이를 한 LysM/GFP, C57BL/6 동물을 묶은 후, 7일 후 혈액 개통 여부를 FACS로 확인하였다. 성공적으로 개통이 된 동물 쌍을 4주간 고지방식이를 한 후, 조직을 얻어 GFP로 표지된 대식세포를 분석하였다. 하지만 이 결과에서도 recipient 동물에서 GFP표지된 대식세포가 관찰되지 않았다. 이 두 번의 실험은 고지방식이 환경에서 혈액에 존재하는 단핵구가 시상하부로 거의 침윤되지 않음을 시사한다.
대식세포의 근원을 확인해 보기 위해 국소적인 분열이 일어나는지의 여부를 확인해 보기 위해 Ki67 면역 염색을 수행하였다. Ki67은 세포 분열 모든 주기에 발현하는 단백질로, 정상 중추신경계에서는 거의 발현되지 않는 단백질이다. 면역 염색 결과, 고지방식이를 한 동물의 시상하부에서 Ki67+ 세포가 관찰되었으며, 이 세포는 일부 perivascular macrophage와 meningeal macrophage에 제한적으로 관찰되었다. 이는 시상하부에서 고지방식이에 의해 골수 유래 대식세포가 상기 세포들을 중심으로 분열을 통해 증식된다는 사실을 보여주는 결과이다.
이처럼 분열하는 세포들이 처음부터 어디에 위치하고 있었는지를 확인하기 위해서 embryo와 neonate의 시상하부에서 GFP+ myeloid cell을 분석하였다. Embryo는 embryonic day 16.5, 18.5를 분석하였고, neonate는 postnatal day 1 (P1), P7, P14, 그리고 P28을 확인하였다. 흥미롭게도 GFP 염색 결과는 예상과 달리 adult period와 다르게 시상하부 전역에 myeloid cell이 분포하는 것을 관찰하였다. E16.5부터 급수적 증가 양상을 보이던 GFP+ myeloid cell은 3주령이 될 때까지 증가하다가 P28에 다다르면, 대부분의 세포들이 감소하여 meninges, median eminence, 그리고 일부 perivascular area에만 존재하며 adult 시기의 macrophage와 유사한 분포를 보인다. 이 세포들과 Iba1+ resident microglia과의 연관성을 확인하기 위해, 각각의 stage에 얻은 slice를 이용하여 GFP, Iba1 double staining을 수행하였다. 그 결과, GFP+ myeloid cell과 Iba1+ microglia가 대부분 merge되지 않는 것을 확인하였고, 이는 각각은 서로 다른 origin을 가지고 있음을 시사한다. 그리고 4주 이후 parenchymal area에서 급격하게 감소하는 골수유래 세포는 배아 시기에 뇌를 자유롭게 왕래하다가, BBB가 establish된 이후 유입이 억제되어 2~3 주의 lifespan을 마치고 제거되는 것으로 판단할 수 있다. 이후에는 주로 ME 부분에 존재하며, 일부 perivascular area에 존재하다가 특정 염증 신호에 의해 증식 및 조직으로 이동하는 것으로 해석된다.
추가적으로, 고지방식이로 인해 어떠한 유전자의 발현이 변하는지 확인해 보기 위해, 시상하부 조직을 얻어 세포 증식과 밀접한 관련이 있는 nitric oxide (NO, 산화질소)를 생성하는 단백질인 NOS(eNOS, iNOS and nNOS)들과, 혈관 관련 유전자(VEGFA, VEGFR2, HIF-1α, Angiopoietin-1 and angiopoietin-2)들의 발현을 분석하였다. 그 결과 고지방식이에 의해 시상하부에서 HIF-1α와 iNOS의 발현이 유의하게 증가된 것을 확인하였다. 이 중에서 HIF-1α는 단백질의 양에 따라 그 효과가 조절되는 만큼 western blotting을 통해 HIF-1α의 단백질 양을 확인해 보았고, 고지방식이에 의해 그 단백질의 양은 변하지 않음을 확인하였다. iNOS는 고지방식이를 비롯한 다른 염증성 질환에서 발현량이 증가되어, 추가적인 염증 반응과 세포 분열에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 iNOS는 혈액을 순환하는 염증성 단핵구의 표지자로도 사용된다.
먼저 iNOS가 골수 유래 세포에서 발현되는지 확인해 보기 위해 고지방식이를 한 LysM/GFP 동물의 시상하부 조직에서 GFP와 iNOS 공동염색을 수행하였다. iNOS 또한 정상 상태의 중추신경계에서는 발현되지 않는다. 염색 결과, iNOS는 고지방식이 동물의 시상하부에서 골수 유래 대식세포, 특히 perivascular macrophage에서 발현되는 것이 관찰되었고, palmitate를 이용한 in vitro 실험에서도 iNOS의 발현은 대식세포 특이적임을 확인할 수 있었다.
iNOS로 인한 대식세포의 분열 및 염증을 억제하기 위해 general NOS 저해제(L-NAME)와, iNOS-특이적 저해제(L-NIL)이 사용되었다. 실험하기에 앞서, L-NAME와 L-NIL이 정상 상황에서 먹이 섭취와 몸무게 변화에 영향을 주지 않는 농도를 찾기 위해 feeding study를 수행하였고, 각각의 농도를 한번 주입 당 0.1μg로 결정하였다. 실험은 일반식이/생리식염수 주입군, 고지방식이/생리식염수 주입군 그리고 고지방식이/저해제 주입군으로 나뉘며, 15주간 일반식이 및 고지방식이를 수행한 후 5일간 매일 아침에 정해진 시약을 주입하였다. 그 결과 두 저해제들은 모두 고지방식이로 인해 증가되었던 시상하부 내 골수 유래 세포의 수를 크게 감소시켰다. 또한 렙틴에 대한 반응성이 개선되었는지를 확인해 보기 위해 feeding study와 P-STAT3의 면역 염색을 수행하였다. 그 결과, 고지방식이로 억제되었던 렙틴의 반응성이 두 저해제들에 의해 개선되었고, STAT3의 인산화도 회복되었다. 마지막으로 L-NIL 저해제에 의해 시상하부 조직에서 IL-1β, IL-6 그리고 TNFα와 같은 염증성 사이토카인의 발현이 크게 감소하였다. 흥미로운 점은 이러한 개선된 양상은 시상하부에 존재하는 microglia 수의 감소가 아닌, 골수 유래 대식세포의 수적 감소만으로 이루어졌다는 것이며, 이는 GFP 표지 대식세포와 Iba1의 공동 면역염색을 통해 증명되었다.
앞서 언급했듯이, 알츠하이머병, 다발성 경화증과 같은 중추신경계 질환뿐만 아니라 근육, 간과 같은 말초 조직의 염증 질환에서도 iNOS의 발현이 증가하고, 이를 억제하면 염증이 개선된다는 내용은 보고되어 왔다. 하지만 그 정확한 메커니즘은 현재까지 잘 알려지지 않았고, 특히 비만에 있어서는 거의 알려진 바가 없다. 본 연구결과로, 식욕과 대사의 중추인 시상하부에서 고지방식이로 인해 일어나는 염증 질환이 산화질소를 매개로 한 메커니즘을 통해 골수 유래 세포를 중심으로 일어남을 확인하였다. 또한 이 세포의 증식을 억제함으로써 대사 질환을 조절하는 방법을 제시하였고, 이는 새로운 염증질환에 대한 약물 개발로 활용할 수 있을 것으로 전망한다.
