Compared to small molecules, protein has more specific, sophisticated and various functions. Therefore, protein has been used in basic science and biotherapeutics. However, the use of protein is limited in investigating cytoplasm of the mammalian cells because of the cell membrane. Intracellular protein delivery systems have been developed for a long time, there is no established platform. Here, I made genetically-encodable and receptor-specific intracellular protein delivery carrier using bacteria toxins.
Shiga like toxin 2 (SLT-II), a protein toxin from Escherichia coli (E. coli), has evolved to deliver their protein toxin into the cytoplasm of the host cells. By adopting the delivery system of SLT-II, I successfully developed a intracellular protein delivery system (Shiga-like Toxin based protein delivery Carrier, STC). STC efficiently delivered fluorescence protein (EGFP) into the cytoplasm of the mammalian cell lines in receptor specific manner. Moreover, the changing of receptor specificity was demonstrated using RGD motif. However, the expres-sion level of STC was too low when some protein cargo was fused to STC.
Pseudomonas exotoxin A (PE), a protein toxin from Pseudomonas aeruginosa, was adopted to solve the problem. The translocation domain of PE enabled a single-polypeptide delivery system. By combining the receptor binding domain of SLT-II (StxB) and the translocation domain of PE (TDP), I developed versatile protein delivery platform named the StxB-TDP system. This system successfully delivered various proteins including enzymes and binding peptide. In vivo applicability of the StxB-TDP system was demonstrated using tumor xenograft mouse model.
To verify wide applicability of the StxB-TDP, I used it for the signaling modulation. PEA-15 is a human protein which regulated the function of ERK2. I delivered non-inactivatable PEA-15 using the developed protein delivery system. Delivered PEA-15 effectively modulated the ERK2 signaling, which induced the cellular apoptosis. Next, PEA-15 was engineered to have higher affinity toward ERK2 using phage display method. As a result, the affinity was increased 800-fold and the cytotoxicity was also increased.
There results indicate that a new intracellular protein delivery system was successfully developed using bacterial toxins, and it is efficient enough to be used in many purposes including signaling modulation. This StxB-TDP system also showed potential to be a biotherapeutics for the treatment of diseases.
소분자 물질에 비하여 단백질은 더 특이적이고 복잡하고 다양한 기능을 갖는다. 그래서, 단백질은 기초 과학 및 의약학 분야에서 중요하게 쓰인다. 그러나, 단백질은 세포막을 뚫을 수 없기 때문에, 세포질에서의 사용이 제한적이었다. 단백질을 세포 내로 전달하는 시스템을 개발하기 위한 오랜 노력에도 불구하고, 아직 정립된 방법이 없다. 우리는 이 논문에서 유전자적 부호화가 가능하고 수용체 특이적인, 단백질의 세포 내 전달 시스템을 박테리아 독소 기반으로 개발하였다.
시가톡신은 대장균에서 생성되는 독소로써, 세포독성단백질을 숙주의 세포질 내로 전달할 수 있도록 진화하였다. 시가톡신의 시스템을 이용하여, 우리는 성공적으로 단백질의 세포 내 전달 시스템(STC)을 개발하였다. STC는 효과적으로 녹색형광 단백질을 포유동물 세포주의 세포질 안으로 전달하는데 성공하였다. 게다가, 이 시스템의 수용체 특이도를 RGD를 이용하여 성공적으로 전환하였다. 그러나 STC는 종종 카르고단백질이 결합되면 발현율이 떨어진다는 단점이 있었다.
녹농균 외독소 A 는 녹농균이 생성하는 단백질 독소이다. 우리는 이 독소를 이용하여 상기 단점을 해결하였다. 이 독소의 전치부를, 시가톡신의 수용체 결합부와 결합하여, 우리는 유용한 단백질 전달 시스템인 StxB-TDP 플랫폼을 개발할 수 있었다. 이 플랫폼은 효소와 결합단백질을 포함한 다양한 단백질을 세포질 내로 전달하는데 성공하였다. 또한, 종양이식 마우스 모델을 이용하여, 살아있는 동물에게 직접 사용할 수 있음을 보였다.
새로 개발된 StxB-TDP 플랫폼의 다양한 활용가능성을 증명하기 위하여, 우리는 이 기술로 세포 내 신호 조절을 시도하였다. PEA-15는 인간유래 단백질로, ERK2 의 활성을 조절한다. 우리는 불활성화가 방지된 PEA-15를 상기 개발된 시스템을 이용하여 세포질 내로 전달하였다. 전달된 PEA-15는 ERK2 신호전달을 효과적으로 저해하였고, 세포사멸을 유도하는데 성공하였다. 그 다음, 우리는 PEA-15와 ERK2 사이의 결합력을 올릴 수 있는 가능성을 알아내었고, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 성공적으로 결합력을 상승시킬 수 있었다. 결합력이 상승된 PEA-16은 더 강한 ERK2억제력을 보여주었고, 더 효과적으로 세포사멸을 유도함을 확인할 수 있었다.
이 결과들은 우리가 단백질의 세포 내 전달 시스템을 박테리아 독소를 이용하여 성공적으로 개발 되었음을 말해준다. 그리고 이 효과적인 단백질 전달 시스템은 세포 내 신호조절 등의 응용이 가능하였다. 본 성과물은 기초 과학 연구는 물론 항암제 등의 단백질 치료제의 개발에 큰 도움을 줄 것으로 기대 된다.
