Facing with worldwide problem, extreme weather such as drought, flooding, and cold wave which is caused by global warming, renewable energy has gotten lots of interests. Among the various kinds of renewa-ble energy, microalga based biofuel is considered as future energy, because it is renewable, carbon neutral, no-competitive in food problem, and equal for all country where there are water and sun. However, algal bio-fuel needs more improvements in biomass and lipid productivity, and this depends on the performance of cultivation. Therefore, cultivation was studied using various kinds of methods to enhancing their perfor-mance and economic feasibility. In order to achieve these goals, I tested microalgae cultivation by using or-ange peel waste. Orange peel waste is the largest waste from juice manufacturing facility, so it is already con-centrated. In addition to that, after the juice squeezing process, they still have lots of nutrients like saccha-rides, phosphate, amino acid and so on. Orange peels have long been used as cattle feed in form of pellet with low price, so it needs development in additional value. Furthermore, orange peel from juice manufacturing factory is clean and familiar with people, therefore it has more salability in human edible valuable nutrient like DHA or phytochemicals.
In this study, I have done these three experiments.
First of all, I treated orange peels with various pretreatment processes to achieve as much as algae ed-ible nutrients. Considering the economic nutrients and biodiesel production, I tested optimum ratio of orange peel and solvent, and aqueous extraction time in room temperature without any acid/base addition. In addi-tion, to achieve more amount of nutrient, aqueous extraction using autoclave was also adapted. With the results from this step, I made two types of orange peel extract to cultivate microalgae for producing biofuels and value added chemicals.
Secondly, I conducted mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris OW-01 to produce biofuel. In order to cultivate Chlorella vulgaris, I optimized pH and concentration of nitrate, and conducted compara-tive cultivation with ordinary medium. Cells cultivated in orange peel extraction had 4 times more biomass and FAME productivity, and even more, they had better quality of biodiesel.
In third, I conducted heterotrophic cultivation of Aurantiochytrium sp. KRS101 to produce more val-ue added DHA with biofuel. Optimization of pH, N source, concentration of nitrate, and added amount of glucose was conducted. 1.2 g/L NaNO3 added orange peel extract showed the best ratio between output DHA yield and input glucose and fructose even compared with high-cost ordinary basal medium.
As a result, orange peel was perfectly used as nutrient source for algal cultivation using the quizzing and pellet manufacturing process which is included in previous juice production process Heterotrophic of Aurantiochtyrium showed better biomass, FAME yield than mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. And considering the produced amount of orange peel from juice manufacturing facilities in U.S. is estimated upto 0.62 MMT per year, and this amount can be calculated to 3.1 MMT OPE medium, 13.64 kMT dry bio-mass of Aurantiochytrium sp., and 6.57 kMT FAME with 1.95 kMT DHA. It seems that the amount of pro-duced DHA using OPE can substitute 42% of previous DHA production from microalgae and this production could make additional $148 million.
경제적인 미세조류의 배양을 위해선 포토오토트로픽 배양이 가장 이상적이었으나, 현재 사용할 수 있는 종 및 배양 조건에서는 그 생산성이 충분하지 못하다는 게 정설이다. 이를 개선하기 위해 믹소트로픽 혹은 헤테로트로픽 배양이 많이 테스트 되어왔지만 추가적인 탄소원의 공급은 많은 비용추가를 야기하였기에 경제적인 문제점을 항상 동반하였다. 대안으로 폐자원 및 폐수를 이용한 배양이 시도 되었지만 폐수 및 폐기물의 특성상 발생되는 양이 일정치 않고, 성상 또한 지속적으로 변하기 때문에 안정적인 수급 및 제어가 어려우며, 폐기물 자체의 처리를 위해선 추가적인 공정에 따른 비용이 발생하기 때문에 그 한계를 보여왔다.
본 연구에서는 이를 오렌지 껍질을 이용해 해결하고자 하였다. 오렌지 껍질은 세계에서 가장 많이 소비되는 과일이며, 무게의 절반 정도가 껍질이라 폐기량이 많다는 점, 공정으로 이미 시스템화 되어있는 오렌지 주스 생산 공정 기준으로 전세계적에서 약 2 MMT, 미국에서 약 0.62 MMT 정도가 꾸준하게 발생하고 있다는 점을 고려할 때 안정적인 공급이 가능하다. 또한 많은 영양분을 함유하고 있고, 추출 후 부산물은 기존의 사용하던 대로 가축의 사료로 사용할 수 있다. 또한 깨끗한 이미지를 가지고 있는 과일 껍질이기에 사람이 먹을 수 있는 고부가가치 물질을 생산하는데 활용된다면 그 가능성이 무궁무진하다고 보았다.
본 학위논문에서는 기존의 낮은 가치를 가지고 있었던 오렌지 껍질을 활용해 미세조류 배양에 이용하기 위해 다음과 같이 전처리를 하고 배양 조건을 최적화 하여 바이오 연료 및 DHA 생산을 위한 배양을 수행하였다.
1. 우선 오렌지 껍질과 물을 다양한 비율로 분쇄하여 교반이 잘되고 필터링 하기에 용이한 비율을 찾았고, 1:5 (w:v)의 비율이 가장 적당한 것으로 판단하였다. 정해진 비율에서 분쇄 후 시간에 따라 녹아 나오는 C source, N source, P source의 양을 비교해 본 결과 am-monium, nitrate 등의 N source는 거의 존재하지 않았고, phosphate는 8시간 까지 그 농도가 증가하다가 이후부터는 큰 변화가 없었다. 유기산의 경우 추출 초기부터 거의 일정한 농도를 보여주었다. Sucrose와 glucose의 경우 sucrose는 감소하는 반면, glu-cose는 증가하였는데 이는 두 carbon source가 녹아 나오기 보다는 추출 초기부터 이미 대부분이 추출되었고 유기산 하에서 sucrose가 분해되어 가면서 glucose의 농도가 늘어나는 것으로 확인할 수 있었다. 그러므로 8시간 정도의 추출이면 필요한 영양분을 대부분 얻어낼 수 있다는 결론에 도달하였다. 이렇게 얻은 추출물 내 화학물질 분석을 통해 orange peel extract는 많은 양의 carbon source와 trace element를 가지고 있었고, 미세조류 배양에 충분한 양에 phosphate가 있는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 orange peel extract의 pH는 약 4 로서 pH를 조절해 주는 것이 필요하다는 것을 알 수 있었고, N source가 거의 전무하였기에 추가적인 N source 공급이 필요하다고 판단하였다. 또한 유기산이 많이 함유되어있기 때문에 autoclave를 통해 더 많은 C source를 얻고자 하였으나, pectin 층의 부풀어 오름으로 인해 추가적인 공정이 필요한 것으로 판단되어 물을 이용한 추출만 하는 것이 경제적이라고 결론 내렸다.
2. 위에서 확인한 추출 조건을 바탕으로 orange peel extract를 만들어 바이오 디젤 생산을 위한 Chlrolella vulgaris OW-01종의 믹소트로픽 배양에 활용해 보았다. pH 최적화 실험에서는 중성 pH (pH 7)에서 가장 좋은 배양 결과를 보여주었고, nitrate 농도 최적화 실험에서는 $NaNO_3$ 를 많이 넣어주면 많이 넣어줄수록 성장 및 FAME 함량이 증가하는 경향을 보여 1.5 g/L가 최적의 조건이라고 확인하였다. 앞서 결정된 최적 조건 하에서 일반적으로 가장 많이 사용되는 배지인 BG 11에 orange peel extract 내 glucose와 같은 농도로 5 g/L의 glucose를 넣고 믹소트로픽 배양을 비교해 본 결과 orange peel extract를 이용한 배양이 바이오매스는 약 3.4배, FAME은 4.5배 더 많이 얻어낼 수 있다는 결과를 얻었다. 또한 biomass quality를 비교해보았을 때 oleic acid의 비율이 더 많은 것을 확인할 수 있었는데, 이는 더 양질의 바이오 디젤을 얻어낼 수 있다는 것을 의미하므로 오렌지 껍질을 이용한 미세조류 배양이 바이오 디젤 생산 측면에서 충분한 가치를 지녔다고 보았다.
3. 앞선 결과에서 바이오 디젤 생산에 orange peel extract가 기존 배지와 비교해 우수한 결과를 가진다는 것을 확인하였지만, 오렌지 껍질이 깨끗하고 사람들에게 친숙하다는 점에서 더 큰 부가가치를 창출 할 수 있을 것이라 판단하여 orange peel extract를 이용한 Aurantiochytrium sp. KRS101 종의 헤테로트로픽 배양을 통해 DHA를 생산해 보고자 하였다. pH 최적화 실험에서는 산성 조건 (pH 5.5)이 가장 좋은 것으로 확인되었고, 다양한 저가 N source를 테스트 해보았을 때 Urea가 가장 높은 바이오매스를 얻어낼 수 있었으나 DHA 함량 및 yield를 고려하면 NaNO3가 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다. $NaNO_$ 3의 농도의 최적화를 진행해 보았을 때, 1.2 g/L의 NaNO3 에서 가장 높은 바이오매스 및 DHA yield를 가져 최적 농도라고 판단하였다. 추가적으로 glucose를 넣어주어 얻을 수 있는 DHA를 따져보았을 때, glucose가 들어가는 편이 더 많은 DHA를 얻을 수 있으나 경제적인 면을 고려하여 결정해야 할 것으로 보인다. 들어가는 glucose 대비 얻어낼 수 있는 biomass가 많은 것은 glucose 외에도 fructose 및 malic acid를 대사할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한 orange peel extract를 사용하여 DAH를 생산할 시 원료비 절감효과도 확실한 것으로 확인되었다.
위 결과로 종합해 볼 때 orange peel extract를 이용한 미세조류 배양은 매우 적합했던 것으로 판단된다. 특히 오렌지 껍질을 이용한 DHA 생산의 경우에는 가격적인 면뿐만 아니라, 오렌지 껍질이라는 사람에게 친숙하고 유기물에서 DHA를 만든다는 점에서 매우 큰 시너지를 만들 수 있을 것이라 판단한다.
매해 미국에서 생산되는 오렌지 껍질이 약 0.62 MMT에 이른다는 점을 고려할 때 이는 약 3.1 MMT의 orange peel extract를 만들 수 있고, 이를 Aurantiochtyrium sp. KRS101 배양에 이용한다면 이는 13.64 kMT의 바이오매스와 6.57 kMT의 DHA를 만들 수 있을 것으로 보인다. 이는 2013년 기준 미세조류 유래 DHA의 약 42%를 대체할 수 있는 양으로서, or-ange peel extract를 이용한 DHA 생산은 생산성 면에서도 충분한 미래를 가지고 있다고 보인다.
