LIN28A has emerged as a key regulator of various biological pathways in embryonic stem cells (ESCs), however the regulatory mechanism by which LIN28A-mediated miRNA processing in the nucleus contributes to pluripotency is largely unknown. Here, we show that SET7/9, a histone mono-methyltransferase, associates with LIN28A. SET7/9-mediated methylation increases LIN28A nuclear reten-tion and protein stability as well as multimerization of nuclear LIN28A to pri-let-7 miRNA. Using an RNAi knockdown approach, we reveal that nuclear LIN28A functions in the nucleoli of ESCs by sequestering the pri-let-7 and blocking its processing via a TUTase-independent mechanism. The nuclear LIN28A regulates transcriptional changes of MYC-pathway targets through maximum inhibition of let-7 biogenesis, thereby maintaining stemness and inhibiting differentiation by modulating stem cell and early lineage-specific mark-ers. These findings provide new insight into the molecular mechanism underlying the post-translational meth-ylation of nuclear LIN28A and its ability to modulate pluripotency by controlling pri-let-7 miRNAs in human ESCs.
LIN28A는 배아줄기세포의 자기 재생과 전분화능 그리고 분화와 발달과정을 조절하는 중요한 조절인자로 알려져 있으며, 줄기세포뿐만 아니라 암세포의 조절에 또한 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 OCT4, SOX2, NANOG 등과 함께 유도만능줄기세포의 제작에 필요한 중요 인자로도 이용되고 있다. 예쁜꼬마선충에서 처음 발견된 LIN28은 대표적인 마이크로 RNA중 하나인 let-7 마이크로 RNA의 성숙과정을 저해함으로써 발달의 시점을 조절하는 역할을 수행하는 것으로 알려졌으며 진화를 거치면서 LIN28A과 LIN28B의 두 상동체로 진화하였다. 기존 연구에 따르면 LIN28A는 주로 세포질에서 TUTase-의존적으로 let-7 마이크로 RNA의 성숙을 방해하고, LIN28B는 주로 핵 내에서 TUTase-비의존적인 방법으로 let-7 마이크로 RNA의 생성을 저해하는 것으로 알려졌으나 핵 내에 존재하는 LIN28A이 어떻게 let-7 마이크로 RNA를 조절하는지에 대한 내용은 연구는 이루어지지 않았다.
본 연구에서 히스톤 모노메틸화 효소인 SET7/9이 LIN28A과 결합하여 135번 라이신을 특이적으로 메틸화하는 것을 발견하였으며, 이를 통해 LIN28A 단백질의 안정성이 증가한다는 사실과 주로 세포질로 존재하는 것으로 알려진 LIN28A가 메틸화로 인해 세포 내 위치가 핵, 특히 인으로 바뀐다는 사실을 확인했다. 이 메틸화 된 핵 내 LIN28A는 let-7 마이크로 RNA 성숙단계의 중간체 중 하나인primary let-7 (pri-let-7)과의 다중 결합체 형성을 촉진함으로써 let-7 마이크로 RNA의 성숙을 더욱 저해한다는 사실을 밝혀냈다. 이는 LIN28A가 세포질에서 TUTase-의존적으로 let-7 마이크로 RNA 성숙을 저해하는 방법 이외에도 SET7/9에 의한 메틸화에 의해 TUTase-비의존적으로도 핵 내에서 let-7 마이크로 RNA의 성숙을 저해한다는 새로운 분자적 기전을 밝혀낸 것이다.
실제로 siRNA를 이용하여 인간 배아줄기세포에서 SET7/9과 LIN28A를 유전자 침묵시킨 후 성숙한 let-7 마이크로 RNA에 의해 발현이 조절되는 표적 유전자들의 발현양상을 genome-wide하게 확인한 결과 성숙 let-7 마이크로 RNA가 증가함에 따라 표적 유전자의 발현도 조절되며, 초기 분화 마커의 발현 또한 증가하는 사실을 확인했다. 반면 유전자 침묵이 일어난 줄기세포에 SET7/9과 LIN28A를 다시 도입했을 경우 성숙 let-7 마이크로 RNA의 생성이 감소하며, 그에 따른 표적 유전자들의 발현 조절 기능도 떨어지는 것을 밝혔으며, 초기 분화 마커의 발현이 감소한다는 사실을 통해 SET7/9에 의한 LIN28A의 메틸화에 의해 줄기세포의 전분화능이 유지된다는 사실을 확인했다.
본 연구를 통해 LIN28A는 SET7/9에 의한 메틸화로 인해 pri-let-7과 다중결합체를 형성함으로써 세포질뿐만 아니라 핵 내에서도 성숙let-7 마이크로 RNA의 생성을 저해하는 것을 확인했다. 이는 SET7/9에 의한 LIN28A의 메틸화가 줄기세포의 전분화능을 유지하는 분자적 기전이라는 사실을 밝힌 것으로, 이를 통해 LIN28A에 의한 배아줄기세포의 전분화능 조절과 줄기세포의 특성을 이해하는데 큰 도움이 될 것으로 생각한다.