Glyoxal (GO) and methylglyoxal (MG) are α-oxoaldehydes produced by diverse mechanisms in cells. As the compounds have two reactive carbonyl groups, the intracellular proteins and DNA are disrupted by the compounds. As a result, there are diverse detoxification mechanisms of carbonyl stress. In this study, two types of detoxification processes were suggested. One is the YqhD system, the NADPH-dependent aldehyde reducing mechanism, and the other is the cofactor-free glyoxalase III system, the DJ-1 homolog proteins, YajL, YhbO, and ElbB, mechanisms.
The reason for focusing on the YqhD GO-detoxification system is due to the isolated GO-resistant $(GO^R)$ mutants. Fifteen GOR mutants were isolated from 10 mM GO plate and we analyzed the loci of mutations in the mutants. From these data, we found that the mutations were in yqhC gene N-termini sites and, therefore, YqhD protein was over-expressed in the mutants. Purified YqhC was bound to the predicted SoxS binding sites near the yqhD promoter regions, and was tested by EMSA and DNase I footprinting assay. Also, YqhC activated the transcription of yqhD in vivo proved by the reporter assay, using several different lengths of yqhD promoter-inserted reporter vectors. From these data, we concluded that YqhC activates the transcription level of yqhD. In order to explain the detail mechanism of YqhC activator, YqhC mutants were used. As the binding affinity of the mutant YqhC decreased compared with that of wild type YqhC, we measured the structural difference by fluorescence emission scanning. The N-terminal structure of mutant (V80E) showed higher fluorescent intensity compared with that of wild type. Therefore, we suggested that the N-terminal domain structure may be the key factor of unusual yqhD induction, but the exact mechanism is still unknown.
Previous report suggested that Hsp31, the DJ-1 homolog protein in Escherichia coil, is the glyoxalase III, converting α-oxoaldehydes to carboxylic acids in cofactor-free condition. Therefore, we researched whether the other three Escherichia coli genes, yajL, yhbO and elbB also have glyoxalase III activities or not. Purified YajL, YhbO and ElbB exhibited the glyoxalase activity with different substrate specificities, optimal pHs, and metal effects. In case of metal ions, the DJ-1 homolog proteins are commonly inhibited by intracellular concentrated zinc ion. Although the DJ-1 homolog gene deficient mutants did not show the susceptibilities to GOs, over expressions of the homologs enhance cellular protection from exogenously added glyoxals and reduce the glyoxals-dependent increase in intracellular advanced glycation end products (AGEs). Based on their expression primarily during the stationary phase, we speculate that their roles in cell as glyoxalases are manifested during the stationary phase.
Glyoxal (GO) 과 methylglyoxal (MG) 은 대표적인 α-oxoaldehydes로서 세포에서 다양한 과정에 의해 생성된다. 이 물질은 반응성이 높은 2개의 carbonyl group을 가지고 있어 DNA나 단백질과 반응하게 되어 돌연변이나 단백질의 기능저하를 유발한다. 따라서 이 물질은 생체 내에서 무독화시키는 여러 가지 mechanism들이 존재하게 되는데, 본 연구에서 두 가지의 무독화 과정을 언급하였다. 하나는 조효소 NADPH를 이용하는 aldehyde dehydrogenase 인 YqhD가 관여하는 과정, 또 하나는 조효소가 필요 없는 DJ-1 상동단백질 (YajL, YhbO and ElbB)에 의한 과정이다.
YqhD에 의한GO의 무독화 과정에 주목하게 된 배경은 GO에 내성을 보이는 돌연변이 균주를 발견하는 실험에서 시작한다. GO 무독화 과정에 관여하는 유전자를 확인해보기 위해, 10 mM 의 GO plate에서 내성을 보인 15개의 돌연변이 균주를 분리하였고, 이 균주들이 어떤 돌연변이를 가지고 있는지 확인하였다. 그 결과 모든 균주들은 yqhC 유전자의 N-terminal loci에 돌연변이가 있다는 것, 이로 인해YqhD 단백질이 과발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 동정한 YqhC 단백질은 yqhD 유전자 윗쪽에 존재하는 SoxS consensus binding sites에 붙는다는 것을 EMSA와 DNase I footprinting assay를 통해서 확인하였고, 생체 내에서 YqhC에 의해 yqhD의 transcription 이 활성화되는 것을 reporter assay를 통해 확인하였다. 나아가 YqhC binding site가 yqhD의 transcription 활성에 필수적이라는 것도 알았다. 위와 같은 결과를 통하여, YqhC가 yqhD의 transcription activator로서의 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 조금 더 자세한 YqhC의 활성mechanism을 확인하기 위해서 V80E YqhC의 N-terminal domain를 동정하여 wild type과의 conformational 차이를 emission spectra of intrinsic fluorescence 를 측정해서 확인해 보았다. 그 결과 V80E YqhC의 fluorescence intensity가 wild type보다 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 N-terminal domain의 conformational change가V80E YqhC의 활성 증가와 연관이 있을 것이라 추측하였다.
이와 같은 YqhD 관련 pathway 과 함께 또 다른 무독화 과정을 확인하였다. 기존에 대장균 내의 대표적인 DJ-1 상동단백질인 Hsp31이 glyoxalase III 활성을 가지고 있다는 결과를 근거로, 대장균 내의 또 다른 DJ-1 상동단백질들이 glyoxalase 활성을 가지고 있는지 확인해보았다. 대장균에는 Hsp31 이외에 DJ-1 상동단백질이 3개 더 존재하는데, 그것이 YajL, YhbO, ElbB이다. 이 3 가지 단백질을 동정하여 glyoxalase 활성도를 측정해본 결과, Hsp31과 마찬가지로 glyoxalase 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 하지만 이들의 substrate specificity나 적정 pH가 각각 달랐다. 또한 zinc ion에 의해서 DJ-1 상동단백질의 효소활성이 억제되는 것을 확인하였다. 이처럼 동정한 DJ-1 상동단백질의 glyoxalase 활성을 생체 내에서 확인해보기 위해서 DJ-1 상동유전자를 제거한 돌연변이 균주를 구축하여 GO에 대한 감수성을 확인하였다. 하지만 wild type과 크게 차이가 나지 않았는데, 이것은 생체 내 zinc ion으로 인해 나타나는 활성억제와 각 효소가 지닌 최적pH가 다른 사실과 연관이 있을 것으로 추측할 수 있다. 반면에 DJ-1 상동유전자를 과발현을 시킨 균주는 wild type 균주에 비해 GO에 대해 내성을 보였다. 또한 GO와 MG에 의해 발생하는 adduct들 (AGEs)의 축적 정도도 줄어들었음을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 생체 내에서 또한 DJ-1 상동단백질의 glyoxalase 활성을 확인하였다. 또한 DJ-1 상동유전자의 발현을 확인해본 결과, stationary phase에서 발현양이 최대가 되는 것을 확인하였고, 이것은 specific activity를 측정하여 확인하였다. 위의 결과를 토대로 대장균 내의 DJ-1 상동단백질들이 Hsp31과 마찬가지로 glyoxalase 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.
