This thesis presents two types of stepwise microchannel chips for cell-matrix adhesion characterization in multiple shear stress zones: cell adhesion chip based on visual detach-ment observation and cell adhesion chip based on visual detachment observation and impedance analysis.
The previous cell adhesion chips based on visual detachment observation cannot analyze the response of the cells simultaneously in multiple shear stress zones or needs complex structure for formation of the multiple shear stress zones. In addition, since these previous cell adhesion chips are dependent on visual images, they cannot analyze the cell-matrix adhesion state like as contact area and gap between cells and matrix. Therefore, we propose two types of the cell adhesion chips using simple stepwise microchannel with multiple shear stress zones: cell adhesion chip capable of analyzing the cell detachment rate based on visual detachment observation and cell adhesion chip able to characterize both cell detachment rate and cell-matrix adhesion state based on visual detachment observation and impedance analysis.
The cell adhesion chip based on visual detachment observation has stepwise widths between an inlet and outlet port. The chip is able to generate the multiple shear stress levels by varying width of the microchannel. After adhering cells stably on the microchannel, we apply the shear stress levels of 35, 41, 47, 54, 60 $dyne/cm^2$ to the cells by flow of culture media. And then, we characterize the cell detachment rate using visual detachment observa-tion. In the experimental study, we used A549con and A549E-cad (E-cadherin knock downed A549 con cells) human lung cancer cell lines. The A549E-cad cells showed about three to five times lower detachment rate than A549con cells at the shear stress levels of 35~60 $dyne/cm^2$ , thus implying E-cadherin affected in cell-collagen adhesion and strengthened the bond.
The cell adhesion chip based on visual detachment observation and impedance analysis consists of stepwise microchannel and electrode-patterned glass substrate. And the external electrode is plugged in inlet port of the microchannel and it is used to analyze the impedance response with patterned electrode. After attaching the cells on each electrode allocated in stepwise microchannel, we treat the cells with 5 % ethanol media in static condition (0 $dyne/cm^2$) and dynamic condition (1.2, 1.8, 2.5, 3.1, 3.8 $dyne/cm^2$). And then, we characterize the cell detachment rate and cell-matrix adhesion state using visual detachment observation and impedance analysis. In order to verify the toxic effect, we finally measure the cell death rate by staining the cells with Propidium Iodide (PI). In the experiments, we used MDA-MB-231 human breast cancer cells. The cell detachment rate showed steep decrease (about 5.0 %) at the shear stress level of 1.8 $dyne/cm^2$. In the impedance analysis, we estimated normalized $R_{cells}$ and normalized $C_{cells}$, electrical parameters related to cell-matrix adhesion state. Normalized $R_{cells}$ and normalized $C_{cells}$ decreased rapidly as about 8.4 % and 41.2 %, respectively, at the shear stress level of 2.5 $dyne/cm^2$, which means that the change of cell-matrix adhesion state decreased steeply at the shear stress level of 2.5 $dyne/cm^2$. And the cell death rate also showed dramatic decrease of about 33.7 % at the shear stress level of 2.5 $dyne/cm^2$. These results suggests that the cellular response to toxic decreases at the shear stress level of $dyne/cm^2$ and impedance analysis is capable of analyzing the fine toxic response hard to characterize with the visual detachment.
In the thesis, we have designed, fabricated, and characterized two cell adhesion chips (cell adhesion chip based on visual detachment observation and cell adhesion chip based on visual detachment observation and impedance analysis). The present chips have potential for use in cancer metastasis study and drug response analysis through the cell adhesion analysis.
본 논문에서는 다수의 전단응력 내에서 세포-매질 접착력 분석을 위한 2종류의 계단형 채널 칩 (시각적 세포탈락 관찰 기반 접착력 분석 칩, 시각적 세포탈락 관찰 및 임피던스 분석 기반 접착력 분석 칩)을 제안하였다.
기존의 시각적 세포탈락 관찰 기반 접착력 분석 칩들은 단일 채널을 이용하여 동시에 다수의 전단응력을 구현할 수 없거나, 다수의 전단응력을 구현하기 위해 다수의 단일 채널을 병렬 연결하여 그 구조가 복잡하였다. 또한, 시각적 이미지에 의존함에 따라, 세포-매질의 접촉면적 또는 접촉간격과 같은 세포-매질의 접착상태를 분석하기에는 어려움이 있었다. 따라서, 우리는 계단형 채널의 간단한 구조를 이용하여 다수의 전단응력 내에서 세포의 접착력을 분석할 수 있는 시각적 세포탈락 관찰 기반 접착력 분석 칩을 제안하고, 나아가, 세포의 접착상태를 동시에 분석할 수 있는 시각적 세포탈락 관찰 및 임피던스 분석 기반 접착력 분석 칩을 제안하였다.
시각적 세포탈락 관찰 기반 접착력 분석 칩은 채널의 유입구와 유출구 사이에 폭이 계단형으로 변화하는 채널로 구성되어 있다. 채널 내에 세포를 안정적으로 접착한 다음, 채널의 유입구와 유출구에 삽입된 튜브에 세포 배양액을 400 μl/min의 유량으로 공급하면, 채널의 폭에 따라 35, 41, 47, 54, 60 $dyne/cm^2$ 의 전단응력이 발생된다. 이때, 각각의 전단응력에 노출된 세포의 탈락율을 시각적 이미지를 통해 확인한 결과, A549E-cad 폐암세포 (A549con 폐암세포에서 E-cadherin 유전자를 제거한 세포) 가 A549con 폐암세포에 비해 35~60 $dyne/cm^2$ 의 전단응력 전 구간에서 약 3~5배 낮은 값을 보였다. 이를 통해, E-cadherin이 억제됨에 따라 세포-매질 간의 접착력이 강화됨을 정량적으로 확인 하였다.
시각적 세포탈락 관찰 및 임피던스 분석 기반 접착력 분석 칩은 계단형상으로 변화하는 채널과 다수의 전극이 패터닝된 유리기판의 접합으로 구성되어 있으며, 채널의 입구에는 백금전극이 삽입되어 유리기판 위에 패터닝된 전극과 쌍을 이루어 임피던스 신호 분석 시 이용되었다. 채널 내에 세포를 주입하여 전극 위에 접착시킨 다음, 5 % 에탄올 배양액을, 0 $dyne/cm^2$ 의 전단응력 조건에서 세포에 노출 시킨 경우와 25 μl/min 의 유량을 인가하여 실제 암세포 환경에서 발생될 수 있는 1.2, 1.8, 2.5, 3.1, 3.8 $dyne/cm^2$ 의 전단응력 조건에서 세포에 노출시킨 각각의 경우에 대해 세포 탈락률과 접착상태를 분석 하였다. 또한, 5 % 에탄올 배양액의 세포에 대한 독성효과를 증명하기 위해, 기존에 사용 돼오고 있는, Propidium Iodide형광프로브를 이용한 세포염색을 통해 세포 사망률을 추가적으로 분석하였다. MDA-MB-231 유방암 세포주를 이용하여 본 소자의 성능을 검증한 결과, 세포 탈락률은 1.8 $dyne/cm^2$ 에서부터 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. 세포 접착상태의 경우, 임피던스 신호분석을 통해 추출된, 접착상태와 깊은 관련성이 있는 전기적 파라미터인, normalized $R_{cells}$ 과 normalized $C_{cells}$ 을 통해 확인하였다. 그 결과, normalized $R_{cells}$ 과 normalized $C_{cells}$ 은2.5 $dyne/cm^2$ 에서부터 급격하게 감소하였으며, 이는 2.5 dyne/cm2 에서부터 세포의 접착상태 변화가 감소하였음을 의미하며, 안정적인 접착상태를 이루고 있음을 의미한다. 또한, 형광염색을 통해 확인된 세포 사망률도 2.5 $dyne/cm^2$ 에서부터 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. 본 실험 결과를 통해, 독성에 대한 세포 응답이 2.5 $dyne/cm^2$ 에서부터 감소 됨을 알 수 있었으며, 임피던스 신호분석을 기반으로 한 세포접착상태 분석을 통해 시각적 관찰이 불가능한 미세한 세포 독성응답이 가능함을 알 수 있었다.
본 논문에서는 계단형 채널의 간단한 구조를 이용하여 다수의 전단응력 조건에서 세포의 접착력을 분석할 수 있는 두 종류의 칩 (시각적 세포탈락 관찰 기반 접착력 분석 칩, 시각적 세포탈락 관찰 및 임피던스 분석 기반 접착력 분석 칩)을 제안하였고, 이를 실험을 통해 검증하였다. 제안된 접착력 칩들은 향후 암전이 메커니즘 연구와 세포 접착력 분석을 통한 약물 응답분석 등에 적용될 수 있다.
