Weak and transient protein-protein interactions, that can show fast response to the cell environment change, are a key to understand cell signaling. However, their weakly interacting nature followed by high substrate concentration of sub-μM to hundreds of μM requirement in detection makes them hard study. Single-molecule imaging has high detection sensitivity. But diffraction limited observation volume makes its concentration barrier at nM range. Few approaches have successfully broken through the concentration barrier. However, in this study, instead of breaking the concentration barrier, we will bypass it through twisting the imaging scheme without major modification in conventional single-molecule imaging system. Increased bait density allowed us to monitor interactions at low prey concentration which is four orders of magnitude lower than its dissociation constant. It enabled us to quantify intertwined kinetics of signaling proteins: Ras, Raf and Raf dimers. This new scheme can be extended to study kinetics that requires tens of mM range or even further.
약하고 일시적인 단백질간의 상호작용은 세포 환경의 변화에 빠르게 반응하고 적응하는데 필요하여, 세포의 신호전달을 이해하는데 있어서 중요한 열쇠가 된다. 하지만, 약한 상호작용의 특성으로 인해 높은 해리상수를 가지게 되고, 마이크로 몰농도 혹은 그 이상의 농도의 단백질이 필요하게 되어, 연구하는데 있어 어려움을 주게 된다. 단분자 이미징 기법은 분자 하나를 관찰 할 수 있는 높은 민감도를 가진 기법이다. 하지만 회절 한계로 인해 가지게 되는 관찰 가능 부피의 제한은 최대 수십 나노 몰농도 수준의 농도로 그 관찰 범위를 제한하게 된다. 이러한 한계를 극복하기 위해 몇 가지 방법들이 개발되어, 성공적으로 높은 농도에서의 관찰에 성공하였다. 하지만 그를 위해서는 광학 시스템에 근본적인 변화가 필요했고, 또한 높은 농도의 단백질 또한 요구된다. 하지만 본 연구에서는 관찰하는 단백질의 농도를 높이는 대신, 광학 시스템에 큰 변화 없이 기존의 단분자 이미징 기법을 이용하여 약한 상호작용을 관찰하는 기법을 개발하였다. 관찰하는 단백질의 농도 대신, 해당 단백질의 파트너 단백질의 표면 밀도를 높임으로써 해리상수의 네자릿수 이하의 농도에서 상호작용의 관찰에 성공하였다. 이를 통해 신호전달 단백질인 Ras와 Raf사이의 상호작용을 정량적으로 밝혀낼 수 있었다. 새롭게 개발된 이 기법은 아주 약한 상호작용을 하는 밀리 몰농도 수준의 해리상수를 가진 단백질들의 상호작용에까지 적용될 수 있다.
