A study on the process development for ethanol production from uncooked cassava starch was carried out. Optimization was conducted for the saccharification of uncooked starch by the combined actions of pectin depolymerase, α-amylase, and glucoamylase. The conditions were : pectin depolymerase ; pH 4.5, 45℃, 2 hr, 0.3%(w/w), α-amylase ; pH 6.0, 60℃, 1 hr, 0.03%(v/w), and glucoamylase ; pH 3.5, 60℃, 1 hr, 1.0%(w/w). Simultaneous treatment of these three enzymes yielded better result than stepwise treatment of these enzymes, about by 8%. From the enzymatic hydrolysis of uncooked starch under the optimized conditions, we achieved only 23% of saccharification yield.
For the increase of saccharification yield, several pretreatments such as acid and alkali steeping, irradiation, and sonification on the uncooked starch were introduced to the enzymatic hydrolysis. Among them, acid and alkali steeping showed good results for this purpose.
Acid steeping as pretreatment of uncooked starch was affected by steeping time, steeping temperature, acid concentration, kinds of acid, and particle size of starch. The actual optimum conditions of acid steeping were : steeping of 30 mesh particles of starch in 0.5 N-HCl solution for 12 hr at 60℃, ratio of starch to steeping volume, 1 : 2(W:V).
In this conditions, reducing sugar production by acid steeping was less than 6.8% of total reducing sugar, which meant that acid steeping did not hydrolyze starch significantly, but changed the conformation of starch granules. The structural change of starch granules was observed by scanning electron microscope(SEM) and sedimentation experiment. When starch was steeped in acid solution, original truncated egg-shaped structure with smooth surface changed to more truncated one with rough surface and the size of starch granuled was reduced from about 20 um in diameter to half or much smaller than half.
The saccharified broth containing about 65% of total reducing sugar was fermented at 30℃ with $\underline{Saccharomyces} \underline{cerevisiae}$. Ethanol yield based on theoretical production reached 93% in 3 day-fermentation, which was relatively higher than that of conventional ethanol fermentation, about 90%. Acid steeping of uncooked starch in lower concentration than 0.5 N-HCl enhanced ethanol yield with the increase of acid concentration, but acid steeping in higher than 0.5 N-HCl reduced the final ethanol yield. This inhibitory effect of acid steeping might be resulted from the production of hydroxymethylfurfural(HMF), which was linearly increased with the increase of acid concentration of steeping solution. When starch was steeped in acid solution, it was found that the elimination of pectin depolymerase in saccharification did not affect saccharification yield as well as ethanol yield. This was considered as result of hydrolysis of pectin materials coated starch granules by acid during steeping period.
Alkali steeping as pretreatment of uncooked starch caused viscosity problem due to the swelling of starch granules. This critical viscosity problem was solved successfully by screening the conditions of alkali treatment. The actual conditions of alkali steeping were : steeping in 0.2 N-NaOH solution for 12 hr at 50℃. By alkali steeping negligible reducing sugar was produced, less than 1%. But the conformation of starch granules was completely disrupted and resulted in very similar structure to heat gelatinized form. This conformational change enhanced the saccharification yield up to 65%.
Using this saccharified broth, we obtained 90-94% ethanol yield. On the contrary to acid steeping, treatment of pectin depolymerase with alkali steeping increased the saccharification yield by 5-10%, by which hydrolysis of cassava cell wall appeared to be more susceptible to amylase action.
Besides cassava starch, other starch sources such as rice and sweet potato were well adapted to our new saccharification process.
무증자 카사바 전분질을 사용하여 효율적인 발효 방법에 관하여 연구하였다. 전분질을 당화하기 위하여 pectin depolymerase, α-amylase, glucoamylase 를 사용 하는데 이 들의 무증자 전분에 대한 최적 조건은 다음과 같다. Pectin depolymerase; pH 4.5, 45℃, 2 hr, 0.3% (w/w), α-amylase; pH 6.0, 60℃, 1 hr, 0.03% (w/w), glucoamylase; pH 3.5, 60℃, 1 hr, 1.0% (w/w), 세 효소를 동시에 처리하고 계속해서 반응 조건만 바꾸어 주는 효소의 동시처리 방법이 단계별로 효소를 처리하는 것 보다 높은 당화율을 보였으며, 최적화 된 조건에서 효소제를 사용하여 무증자 전분을 당화 시켰을 때 전당의 23% 가 당화되었다. 당화율을 높이기 위하여 여러가지 전처리를 실험한 결과 산 침지와 알카리 침지가 좋은 방법으로 나타났다.
산 침지의 실제적인 최적조건은 무증자 전분을 0.5N-HCl 용액에 넣고 60℃ 에서 12 시간 침지하는 것이 적당 하였으며 이때 사용한 전분 입자의 크기는 30 mesh 였으며 전분질 : 침지용액 부피는 1 : 2로 하였다. 이러한 조건에서 침지 시킨 후 효소제를 사용하여 당화하면 65% 의 당화율을 얻을 수 있었다. 산 침지만 으로는 6.8% 이하의 환원당이 검출되어 산에 의한 가수분해는 거의 일어나지 않는 것으로 생각되었다. 전자현미경 (SEM) 으로 산에 의한 전분의 구조적 변화를 관찰해 보면 원래의 둥근 달걀 모양이 표면이 훨씬 거칠어 지고, 그 크기도 작아진 것으로 나타났다. 최적 조건에서 침지, 당화한 용액을 $\underline{Saccharomyces} \underline{cerevisiae}$를 이용하여 30℃에서 3 일간 발효시킨 결과 93% 의 에탄올 수율을 얻을 수 있었다. 침지시킬 때 산의 농도가 최종 에탄올 생성에 영향을 미치는데, 0.5N-HCl 용액까지는 에탄올 수율이 증가되는 현상을 보이나 그 이상의 농도에서는 오히려 수율이 떨어지는 것으로 나타났다. 이것은 hydroxymethyl furfural 의 생성때문인 것으로 사료되며 산으로 침지할 경우 pectin depolymerase 는 당화에 기여하지 못하는 것으로 나타났다.
알카리 용액으로 무증자 전분을 침지하면 전분 입자의 팽윤으로 급격히 점도가 증가되는 현상이 나타나는데 이것은 알카리 농도에 따라서 점도의 변화와 호화 정도를 관찰하므로써 작업이 가능한 점도를 가지고 있으면서 효소제를 처리 하였을 때 높은 당화율을 보이는 알카리 침지 조건을 정하므로써 극복할 수 있었다. 이때 조건은 무증자 전분을 0.2N-NaOH 용액에 넣고 50℃ 에서 12 시간 침지하는 것이다. 알카리 침지만 으로는 거의 환원당이 검출되지 않았고 효소제를 계속해서 처리하면 최종적으로 약 65% 의 당화율을 얻을 수 있었다. 이런 높은 당화율은 알카리 침지에 의한 전분 입자의 구조적 변화로 설명될 수 있었다. 앞에서와 같은 방법으로 발효 하면 90-95% 의 에탄올 수율을 얻을 수 있었다. 산 침지의 경우와는 달리 알카리로서 침지할 경우 pectin depolymerase 에 의하여 5 - 10% 정도의 당화율이 증가되었으며 이것은 pectin 물질이 알카리에 의해서 분해되지 않고 이 효소에 의해서 분해되므로써 당화에 기여하는 것으로 생각되었다.
이상에서 개발된 공정은 쌀, 고구마 등의 다른 전분질 원료에도 잘 적용되어 여러 원료에 이용 가능함을 보여 주었다.
