The enzyme T4 DNA ligase which catalyzes the formation of a phosphodiester linkage between DNA chains was isolated from E.coli λT4 lig lysogen, and its mode of action for cohesive and blunt end termini was characterized by Eco RI, Pst I, Hind III and Sma I-generated pUC 9 as substrates. The isolated T4 DNA ligase has molecular weight of 68,000±3,000 as judged by 12% polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1% sodium dodecyl sulfate and the degree of joining activity was optimum at pH7.4-7.8 in the presence of 10 mM $Mg^{++}$, 10mM DTT. The optimum concentration of ATP was 1.0 mM for cohesive end ligation, 0.2 mM for blunt end ligation.
Both reaction were inhibited by monovalent cations such as $Na^+$, $K^+$, $ NH^+_4$ and $Cs^+$, by polyamines, spermine and spermidine, and by phosphate. Blunt end ligation was more sensitive to these effectors.
Optimum temperature and ligation efficiency of the enzymic reaction was dependent to the base composition of DNA fragments generated by restriction endonucleases. Blunt end joining showed a non-linear dependency on enzyme concentration and required about 40-fold of enzyme in cohesive end ligation.
On the while, the predominant products of the enzymic ligation were gained in either linear concatemers or covalently closed circular forms appropriate DNA concentration, reaction time and enzyme amounts.
T4 DNA ligase는 여러 제한효소로 잘려진 DNA 조각들을 결합시키는 효소로 유전자 조작에 필수 불가결한 도구로 이용되고 있다. 본 실험에서는 E. coli λ T4 lig lysogen으로 부터 이 효소를 분리하고, Eco RI, Pst I, Hind III, 그리고 Sma I 제한 효소로 자른 pUC 9 DNA 를 기질로 하여 분자적, 물리화학적, 촉매적 특성이 연구되었다. 8 g 의 박테리아로 부터 0.25 mg 의 효소를 분리하였고, 분리된 이 효소의 활성도는 1.2×10^4 units/mg 이었다. 이 효소는 0.1% SDS 를 포함하는 12% polyacrylamide gel 상에서 전기 영동한 결과 68,000 ± 3,000 의 분자량을 보였다.
T4 DNA ligase는 pH 7.4 - 7.8, 10 mM DTT 그리고 10 mM $MgCl_2$ 존재하 에서 최대의 결합 활성도를 보였다. 이 효소의 최대 활성도를 위해 cohesive end 에 1.0 mM ATP, blunt end 에 0.2 mM ATP 가 요구되었다.
이 두 말단들의 결합은 $Na^+$, $K^+$, $KN^+_4$ 그리고 $C_s^+$ 같은 일가 양이온 들과 spermine, spermidine 같은 polyamine, 그리고 phosphate 에 의해 저해 되었고, 이중 blunt end 결합반응은 이들에 대해더 급격히 감소 되었다.
Eco RI, Pst I, Hind III 그리고 Sma I 으로 자른 pUC 9 을 결합하는 최적 온도는 각각, 6, 12, 6, 24℃ 이었으며, 온도에 따른 결합곡선은 cohesive end 가 s 자형, blunt end 가 종 모양 이었다. 이들 결합 효율은 제한효소를 자른 DNA 조각 내에 있는 염기 구성에 따라 다르게 나타났으며, 6 개 염기중 양쪽 끝 2 개 염기가 결합 반응에 중요한 역할을 한다고 생각되어 진다.
또한 blunt end 결합은 효소 농도에 직선적인 관계를 보이지 않았으며, cohesive end 결합과 비교해 약 40 배의 많은 효소가 필요했다. 자연 상태의 선형 DNA 와 열 변성된 DNA 들을 사용하여 T4 DNA ligase 에 의한 결합 능력이 비교 되었는데, 열 변성된 DNA 경우에 그 정도가 자연 상태의 DNA 에 비해 10% 정도 밖에 되지 않았다.
이들 결과로부터 cohesive end 결합은 기질이 양쪽 2 개 염기와 안쪽 4 개 염기의 수소 결합으로 효소가 반응하기에 적절한 위치로 놓여져 결합이 일어나게 되며, blunt end 결합은 DNA 에 먼저 결합 된 효소들 간의 상호 작용으로 기질을 유도해 기질의 국부 농도를 높여 반응이 일어나게 된다는 사실을 제시할 수 있었다.
DNA 농도가 낮고 (20 ㎍/ml) 반응 시간을 길게하고 효소 농도를 높게 했을때 선형보다 원형이 훨씬 많이 생기는 사실도 관찰했다.
