This study is concerned with the gene rearrangement of light chain gene of anti-Tac antibody which reacts specifically with human activated T cell.
The main part of this study is in the following three area:
first, large scale isolation of mCh28-$JK_1B_3$ 18 DNA which is a modified Charon 28 DNA containing the light chain DNA for the purpose of obtaining $JK_1B_3$ 18 DNA (light chain DNA). Second, $JK_1B_3$ 18 DNA were subcloned into pBR 322 and large amount of light chain DNA was electroeluted after BamHI digestion for the further study. Third, the electroeluted $JK_1B_3$ 18 fragment was mapped by the various restriction endonuclease by comparing with the restriction enzyme map of mouse embrionic light chain DNAs reported.
Phage DNA mCh28-$JK_1B_3$ 18 was transfected to $\underline{E}.\underline{coli}$ LE 392 in the presence of $CaCl_2$. The resulting phage plaques were hybridized nick translated $J_K$ probe to identify presence of $JK_1B_3$ 18 DNA. Many plaques showed positive result.
To obtain $JK_1B_3$ DNA, phage DNA was digested with BamHI restriction enzyme and electroeluted the 7.2Kb fragment. The fragment was ligated with pBR 322 and transformed to $\underline{E}.\underline{coli}$ HB101. The transformant were identified by the methods of colony hybridization, restriction digestion, and southern blotting hybridization. Transformation efficiency was about $6\times10^6$ transformant per ug pBR 322 DNA. Transformant with recombinant plasmid (pBR322-$JK_1B_3$) was mass-cultured and plasmid DNA was isolated in pure form by the CsCl-EtBr equilibrium density gradient. Finally $JK_1B_3$ 18 light chain DNAs were isolated from hybrid plasmid by electroelution method after BamHI digestion.
Anti-Tac antibody light chain gene were digested with various restriction enzymes and mapped comparing with mouse embrionic light chain gene. Light chain gene are well rearranged by the results of this study. $J_1-J_2$ cluster was deleted and C region are linked to $J_3-J_4-J_5$ cluster. In the case of this deletion 2 HindIII, 1 HphI, 1 Sau3AI, 1 AccI sites are deleted. This deletion leads more closely to J region (V-J recombination).
From the results, anti-Tac antibody gene are activated by V-J joining and it was suggested that this gene can be efficiently expressed.
항체 유전자는 배아 세포로 부터 유전자의 특정 부위가 제거되거나, 첨가, 전환되어 활성을 갖는 유전자 형태로 발생 과정에서 재 배열이 일어나게 된다. 본 연구에서는 Anti-Tac 항체 L 사슬을 유전자 재조합 방법을 이용하여 재조합하고 이 재조합된 DNA 를 이용하여 배아세포 유전자 배열과 재조합된 유전자 와의 관계를 규명하고 L 사슬의 재 배열을 연구하고자 하였다.
$JK_1B_318$ 유전자 (L 사슬에 해당) 를 얻기 위하여 이미 재조합된 mCh28-$JK_1B_318$ phage 을 $\underline{E}.\underline{coli}$ LE392 에 감염 시키고 nick trans lated JK probe 를 이용하여 hybridization 방법에 의해서 $JK_1B_318$ 의 존재를 확인했다. Hybridization 양성 phage 유전자를 분리한 다음 Bam HI 으로 자르고 $JK_1B_318$ 에 해당되는 7.2 Kb fragment 를 분리해 내었다. 앞으로 본 연구에서 $JK_1B_318$ DNA 가 대량으로 필요할 것을 고려하여 pBR 322 plasmid 에 T4 DNA ligase 로 연결한 다음, $\underline{E}.\underline{coli}$ HB 101 에 $CaCl_2$ 존재하에 transformation 하고 각 집락으로 부터 $JK_1B_318$ DNA 가 들어간 집락을 southern blotting hybridization, colony hybridization, restriction digestion 방법으로 확인한 다음 이 hybrid plasmid 로 부터 electro elution 방법으로 $JK_1B_318$ 유전자를 대량 순수 분리해 내었다.
순수 분리된 DNA 를 다양한 제한효소 로서 잘라 fragment를 분석하므로 제한 효소 지도를 만들고 J cluster 의 배열에 관한 연구를 한 결과 쥐의 배아세포의 유전자 배열과는 다른 형태로 존재하고 있음을 알았다. 즉, Eco RI, Xba I, Ava I, Bgl II, 하나의 Hind III, 하나의 Acc I 부위는 그대로 존재하는 반면, 두 개의 Hind III 부위와 하나의 Sau 3 AI, Acc I, Hph I, 부위가 없어진 것을 알 수 있었고, 이 부위는 $J_1-J_2$ cluster 에 해당됨을 배아 세포의 유전자 배열과 비교 함으로써 알아 내었다. 즉 V 부위가 $J_3-J_4-J_5$ 부위로 연결이 되어 있고, $J_1-J_2$ cluster가 제거되어 있다는 사실을 확인하게 되었다.
이상의 연구결과에서 재조합된 L 사슬은 활성이 있는 유전자이고 viral vector system을 이용하여 splicing 되어 intron 부분이 제거 된다면 전핵 세포 내 에서도 Anti-Tac 항체로 발현될 가능성이 있음을 시사한다.
