An enzyme which catalyzes the synthesis of cephalexin from D-α-Phenylglycine methylester (PGM) and 7-amino-3 desacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) was prepared from $\underline{Xanthomonas}$ $\underline{citri}$ IFO 3835, and partially purified 30-fold by ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose, and Sepharose-4B column chromatography.
This enzyme preparation was immobilized onto the several adsorbents by adsorption. Among these, kaolin and bentonite showed a high enzyme activity retention and reusing stability. Activity retentions of enzyme adsorbed onto kaolin and bentonite were determined as 92% and 71%, respectively.
The biochemical properties of immobilized enzyme, such as optimum temperature, PH, and kinetic constants, were investigated and compared with those of the soluble enzyme.
Optimum temperature, PH and Km values for 7-ADCA, PGM and cephalexin of soluble enzyme were determined as 35℃, PH 6.2, 11.1mM, 2.1mM, and 1.61mM, respectively. These parameters of immobilized enzyme were also determined as 37℃, PH 6.2, 11.5mM, 2.1mM, and 2.0mM, respectively.
From the experimental results of kinetics and substrate mole ratio effect on conversion, it was found that the final equilibrium concentrations of cephalexin were influenced by the initial mole ratio of substrates. Therefore, 85% mole base conversion of substrates to product could be obtained at the mole ratio of 1:3 within 2 hr.
Based on the experimental results, we concluded that the cephalexin synthetic reaction was considered to be reversible bi-uni reaction.
Model of a rate equation was derived to describe the enzymatic synthesis of cephalexin. The integrated form of the rate equation has shown to predict satisfactorily the progress of the reaction in a batch reactor.
There was a good agreement between the experimental results and the theoretical analyses performed by computer simulation.
$\underline{Xanthomonas citri}$ IFO 3835 의 균체로 부터 부분적으로 분리한 효소를 사용하여 cephalexin 의 합성반응에 관여하는 제반 인자들에 대하여 연구 하였다. 또한 더 나아가서 이 효소를 산업적 으로 이용하기 위하여 고정화 시키는 방법에 대하여 연구 하였으며, 가용성 효소와 고정화 효소를 이용하여 cephalexin 합성의 최적 조건, 그리고 이들 효소의 kinetics 등을 비교 검토 하였으며, 이로부터 속도 방정식을 유도하고 computer 를 이용하여 속도 방정식을 적분한 결과 단일공정 반응에서 시간에 따른 cephalexin 의 합성 수율이 실험 결과와 잘 일치함을 알수 있었다.
본 실험에서는 28ℓ 용량의 발효조를 이용하여 20ℓ 의 배양액으로 부터 $\underline{Xanthomonas citri}$ IFO 3835 의 균체를 얻고 이를 sonication 시켜서 효소를 추출하고 다시 Ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose 및 Sepharose 4B column chromatography 한 결과 부분적으로 정제된 효소는 추출시의 crude 효소에 비해 그 비활성도가 30 배나 증가되었다.
이 효소를 고정화 시키는 방법으로 흡착법을 사용하였으며, 흡착제로는 celite, activated carbon, silica, kaolin 및 bentonite를 사용한 결과 kaolin 에 흡착된 효소의 경우 가장 높은 효소 활성을 유지할수 있었고 30℃ 에서 10 시간 재 사용시 85% 의 높은 효소 역가를 유지할수 있었다.
가용성 효소와 고정화 효소를 이용하여 cephalexin 합성의 최적 조건을 조사한 결과 가용성 효소의 경우 pH 6.2, 35℃ 였으며, 고정화 효소의 경우 최적 pH 는 변화가 없었고 최적온도는 37℃ 로 이동 되었다. 이로 부터 효소를 고정화 시키므로서 열에 대한 안정성을 더욱 증가시킬수 있음을 알수 있었다.
가용성 효소와 고정화 효소를 이용하여 속도 상수를 구하고 서로 비교 검토 하였다. 가용성 효소의 경우 7-ADCA, PGM 및 cephalexin 에 대한 Km 값은 각각 11.1 mM, 2.1 mM 및 1.61 mM 임을 알았고 고정화 효소의 경우는 각각 11.5 mM, 2.1 mM 및 2.0 mM 임을 알수 있었다. 이로 부터 흡착법에 의해 효소를 고정화 시킬 경우 속도 상수의 큰 변화가 일어나지 않음을 알수 있었다.
기질의 몰 농도비를 다르게 하면서 합성된 cephalexin 의 최종 평형 농도를 구한 결과, cephalexin 의 최종 평형 농도는 기질의 최초 몰 농도비에 크게 영향을 받음을 알수 있었다. 즉 7-ADCA 와 PGM의 최초 몰 농도비를 1:3으로 하므로서 2시간 이내에 몰 농도를 85% 의 수율로 cephalexin 을 합성 할수 있었으며, 이때 7-ADCA 의 초기 농도는 20 mM 이었다.
몇몇 실험결과를 이용하여 아래에 정리해 보면
ⅰ) Cephalexin 의 최종 평형 농도는 기질의 최초 몰 농도비에 크게 영향을 받으며,
ⅱ) Cephalexin 의 최종 평형 농도는 가해준 효소량에 영향을 받지 않았으며,
ⅲ) Cephalexin 의 합성을 촉매하는 같은 효소에 의해 cephalexin의 가수분해가 촉매되었으며
ⅳ) Methanol 은 cephalexin 의 가수분해 반응에 관여하지 않았다.
위의 사실로 부터 cephalexin 합성 반응은 가역 반응이며 bi-uni reaction 임을 알수 있었다.
이 반응 model 에 따라 속도 방정식을 유도하였고 computer 를 이용하여 적분한 결과 단일 공정반응 에서 시간에 따른 cephalexin 합성 과정을 예시할수 있었고 이 결과는 실험결과와 잘 일치함을 보여 주었다.
