In order to develop a program to obtain the high activity and high purity of penicillin acylase, mutation and affinity chromatographic technique were studied using $\underline{Bacillus}$ $\underline{megaterium}$ ATCC 14945.
An extracellular penicillin acylase (EC 3.5.1.11) from the medium of $\underline{B}$. $\underline{megaterium}$ culture was partially purified overall 446 folds by means of adsorption on celite, followed by an affinity chromatography using a Sepharose-1,6-diaminohexyl-penicillin V column. The partially purified enzyme of a specific activity of 1521 U/mg protein on benzylpenicillin showed 3 bands by 7% polyacrylamide gel electrophoresis.
The enzyme was inhibited by both reaction products, phenylacetic acid and 6-aminopenicillanic acid. Phenylacetic acid inhibited the enzyme competitively and 6-aminopenicillanic acid noncompetitively and inhibition constants were 45 mM and 26 mM, respectively Michaelis constant of the enzyme on benzylpenicillin was 4.5mM. The enzyme showed the maximum activity at 45℃ and pH8.7. The activation energy calculated by Arrhenius' method was 4.57 cal/mole.
The enzyme productivity was improved by control of fermentation conditions. When the cells were fermented with 20% inoculum in reciprocal shaker at 250 rpm the enzyme productivity was 36.5 U/ml which was higher productivity compared with that of routine fermentation conditions, 5% inoculum in rotary shaker at 250 rpm, of 15 U/ml.
The strain of $\underline{B}$. $\underline{magaterium}$ ATCC 14945 was improved by mutation with UV irradiation followed by methylmethanesulfonate treatment. Two strains of mutant showed higher productivity of 44 U/ml and 56.6 U/ml, respectively when they were fermented with 20% inoculum in reciprocal shaker at 250 rpm.
$\underline{Bacillus megaterium}$ 의 penicillin acylase ( EC 3.5.1.11 )를 affinity chromatography 방법으로 정제하고 이 효소의 생화학적 특성을 조사하였다. 또한 이 효소의 생산도를 높이기 위한 실험을 하였다. 여러가지 기질 유사체와 경쟁적 저해제의 유사체에 대해 저해 실험 및 affinity chromatography 를 실시해 본 결과 penicillin V 를 Sepharose 에 결합시킨 Sepharose-1,6-diaminohexyl-penV 를 affinity chromatography 의 adsorbent 로 사용하였다. 이때 효소원으로 crude enzyme 을 사용하였을 경우 penicillin acylase의 affinity 가 낮고 다른 단백질도 많이 붙어 이들의 분리가 용이하지 않았다.
그러나 crude enzyme 을 1차적으로 celite 에 흡착시킨 후 분리하여 이것을 효소원으로 사용한 결과 penicillin acylase가 좋은 affinity 를 보였으며 0.06M borate buffer, pH 8.7로 elution 한 결과 crude enzyme 으로부터 446배 정제되었고 전체적 수율은 63%였다. 이것을 전기 영동하였더니 3가지의 단백질 band 가 나타났다.
이 효소의 최적온도와 pH 는 각각 45℃ 와 8.7 이였으며 활성화 에너지는 4.57 Kcal/mole 이었고 Km 값은 4.5 mM 로 나타났다. 또 이 효소의 기질 분해산물인 phenylacetic acid 와 6-aminopenicillanic acid 는 각각 이 효소의 경쟁적 및 비경쟁적 저해제로 나타났고 affinity chromatography 의 ligand 로 쓰인 penicillinV 도 경쟁적 저해제로 나타났다. 이들의 저해 상수는 각각 45 mM, 26mM 과 9.4 mM 이었다. 이 효소의 생산에 있어서 자외선 조사와 화학적 변이유도제를 사용하여 변이종을 만들고 효소 발효시 접종량과 교반양식을 조절한 결과 종래의 생산도 15 U/ml 에서 370 %가 증가한 56.6 U/ml 를 얻을 수 있었다.
