α-D-Galactosidase (E.C. 3.2.1.22) of $\underline{E}$. $\underline{coli}$ was partially purified by DEAE - cellulose and Sephadex G-100 column chromatography and characterized for the further study of the mode of the enzyme action.
The partially purified enzyme preparation showed a specific activity of 65.3 units per mg of protein based on PNPG as a substrate and was purified 28-fold over the crude enzyme, and it was also shown that the general characteristics were in accord with the results of the other reports : substrate specificity, optimum pH 8.0-8.3, optimum temperature 37℃ , 0.71mM for Km, inhibitory effects of several metal ions, and inactivation by dilution and reactivation by $NAD^+$. The role of $NAD^+$ was proposed as a positive modulator and α-galactosidase from $\underline{E}$. $\underline{coli}$ may be an allosteric enzyme.
Further studies on the mechanism of enzyme action, i.e., inhibition study by substrate analogues, determination of the ionization constant of the enzyme and the enzyme substrate complex, and inhibition of the enzyme activity by functional group blocking, agents, were carried out.
As follows, the evidence for the involvement of functional groups was considered. The implication of the essential function of an imidazolium group was suggested by pKa(6.8 - 6.9) value and inhibition by photo-oxidation. The presence of a thiol group could be postulated from the results of inhibition studies by SH - blocking agents (i.e. PCMPS and N- ethylmaleimide) and the effects of heavy metal ions (i.e. $Ag^+$, $Hg^+$, and $Cu^{+2}$). Moreover with DIFP and hydroxylamine, it was approved that the hydroxyl group and carboxyl group would be involved in the active center.
Therefore, based on overall results a model mechanism for the action of α -galactosidase was proposed. In this model mechanism, the sulfhydryl group may act as a general acid and the hydroxyl group as a nucleophile. After being an enzyme-1-α-D-galactosidase intermediate, in removal of the galactosyl group from the enzyme, the sulfhydryl anion may act as a general base to assist the attack of $OH^-$ or $OR'^-$ at the C-1 position of the glycone.
By this model mechanism there will be no inversion of the anomeric carbon at either step in the reaction and the product will retain the α-configuration around the anomeric carbon.
생체의 glycolipid 와 다당류의 대사작용에 중요한 역활을 하고, 제당 및 제약공업에서의 응용성을 가지고 있는 α-D-galactosidase (E.C.3.2.1.22.) 에 대한 효소 반응 기전에 관한 실험을 하고자 E. coli 로 부터 DEAE-cellulose, Sephadex G - 100 column chromatography 에 의해 부분적 정제를 시도한후, 전기영동에 의하여 homogeneity 를 조사하였다.
부분적 정제에 의해 얻어진 결과와 효소에 대한 일반적 특성을 살펴보면, p - nitrophenyl-α-D-galactoside 를 기질로 하였을때 28배의 비활성도 증가를 나타내었고, 최적 pH 8.0-8.3, 최적온도는 37℃, Km 값 $7.1 × 10^{-4}M$ 의 결과를 보였으며, 특이한 현상으로 희석에 의해 효소 활성이 심하게 상실되었으나, $NAD^+$ 를 cofactor 로 사용한 결과 방지 할수 있음이 밝혀졌다.
효소와 효소 - 기질의 복합체에 대한 이온화 상수는 각각 pKa 6.8 - 6.9, pKb 8.9-9.0 이었고, imidazolium,sulfhydryl, hydroxyl, 그리고 carboxyl 기가 효소의 활성부위에 관여할것으로 추정되었으며, 이러한 사실은 딴보고들에 의해서도 충분히 입증 되었다.
이와 같은 실험결과에 의해 active conformation 에서 imidazolium 기는 deprotonate 되어있고, sulfhydryl 기는 protonate 되어 있을 것으로 추정하였다. 여기서 sulfhydryl 기는 general acid 로 작용하여 glycosidic oxygen atom 에 proton 을 전달하게 되고 hydroxyl 기는 인접해 있는 imidazolium 기에 의해 활성화 되어 nucleophile로 관여 할 것으로 간주된다. 그리고 효소와 galactoside 가 결합된 중간체를 거친후 sulfhydryl 기는 general base 로 작용하여 물이나 sugar alcohol 로부터 proton 을 끌어들이게 되어 $OH^-$, $OR'^-$ 가 쉽사리 C -1 위치에 공격 할수 있도록 유도 하게 된다.
이상과 같이 제시된 효소 가수분해 기전은 앞으로 좀더 많은 실험결과에 의해 보완, 수정이 되어야 하겠지만, 이 효소의 생화학적, 생리적 기능과 산업적 응용에서 활성부위의 역활에 대한 정보를 제공 할수 있다는 데서 의의가 있다고 사료된다.
