For the enhancement of monoclonal antibody affinity, a bispecific antibody against two different epitopes in the same antigen has been prepared by chemical recombination. After purification of human chorionic gonadotropin and immunization, splenocytes of immunized mice and myeloma cells were fused using standard PEG fusion technique. Among 288 clones, 8 clones were selected on the basis of subunit specificity, and finally 4 clones (R111, B71, B91, and R40) were selected based upon epitope specificity.
The relative positions of epitopes recognized by these clones were investigated by competitive radioimmuno assay, two-site sandwich radioimmuno assay, and additivity assay. After analyzing these three assay data, we selected a pair of antibody (antibody R111 on $\alpha$ -subunit and B91 on $\beta$ -subunit) as a proper pair for the preparation of bispecific antibody.
Bispecific antibody between antibody R111 and B91 was prepared by chemical recombination using 5, 5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), purified by Sephadex G-150, and characterized.
By the results of SDS-PAGE, dual antigen binding radioimmuno assay, enzyme linked immunosorbant assay, and western blott analysis, we confirmed that this antibody has bispecificity against two different epitopes, one is on $\alpha$ -subunit and the other is on $\beta$ -subunit.
Using Scatchard plot and the other graphical analysis, we confirmed that the affinity of bispecific antibody is as much as 17-fold higher than that of monoclonal antibody with higher affinity and bispecific antibody: antigen reaction is equi-molar interaction.
The characterization of binding mechanism between bispecific antibody and its antigen and application for the development of new immuno assay systems remain to be studied.
단일클론항체의 항원에 대한 친화력을 증진시키기 위하여 동일 항원내의 두 항원결정기에 대한 이중 특이성 항체를 화학적 재조합 방법으로 제조하였다. 본 실험을 하기 위하여 먼저 Human chorionic gonadotropin hormone을 정제하였다. 고순도로 정제된 항원을 사용하여 쥐를 면역시켰으며, 일정기간뒤 면역된 쥐로부터 비장 B-임파구를 분리하여 myeloma 세포와 융합시켰다. 융합된 세포로부터 분비되어지는 항체의 특이성을 조사하여 8 개의 세포융합주의를 선별 하였다. 이중, 안정성과 항체생산능력을 비교하여 4개의 세포융합주를 최종적으로 선별 하였다.
이들 4개의 세포주가 인식하는 항원결정기의 서로 상호간의 상대적인 위치를 확인하기위하여 세가지 방법의 radioimmunoassay 를 수행하였다. 그 결과, R111 세포주와 B91 세포주가 이중특이성 항체를 만드는데 가장 적합한것으로 확인되었다. 따라서 R111 항체와 B91 항체간에 이중 특이성 항체를 만들었으며 그 성질을 조사하였다.
SDS-PAGE,RIA,ELISA 등의 결과를 보면 우리가 제조한 항체가 예상과 같이 서로 다른 항원 결정기에 대한 이중 특이성을 나타냄을 알 수 있으며 또한 평형 상태에서의 결합반응실험결과 를 분석하여보면 각각의 단일클론항체의 경우에서 보다 훨씬 높은 친화도를 가짐을 알 수 있다. 또한 이 항체가 항원과 반응하는 방식이 일반적인 경우와는 다름을 알 수 있다. 즉 이중특이성 항체와 항원과의 반응방식은 서로 같은 mole수의 분자가 결합반응에 참여 하게 되고 그 결과로 친화도가 높아지게 될것으로 추정된다. 따라서 보다 확실한 반응 기작을 알기위해서는 더 많은 연구가 수행되어져야 할 것이다.
