Protein Phosphorylation and dephosphorylation have been generally accepted as one of the important mechanisms in the regulation of diverse cellular reactions. Although the mechanisms of action remain still equivocal, tyrosine phosphorylation of proteins have been reported to be particularly implicated in cell proliferation and differentiation. This assumption is based on the observation that several retroviral oncogenes are related to tyrosine specific protein kinases and that some growth factor receptors also show tyrosine kinase activities. To understand the role of tyrosine phosphorylation, it is essential to find critical target proteins of tyrosine phosphorylation and to characterize their biochemical properties. To this end, $^{32}P$-labeled tyrosine phosphorylated proteins have been searched in chick embryo.
An endogenous 95 KDa chick embryo cytosolic protein with pI 6.8-7.0 was phosphorylated in vitro in the presence of [$\gamma^{-32}P$]ATP. Phosphorylation of the protein was prominent in the embryos of early developmental stage. While the 95 KDa protein was present in the cytosol, the kinase activity for the protein was mostly associated with the particulate fraction. Hydrolysis of the phosphorylated protein yielded phosphotyrosine in addition to phosphothreonine and phosphoserine. Native 95 KDa protein was also phosphorylated on its tyrosine residue. The tyrosine-phosphorylated 95 Kda protein was purified by DEAE-Sephacel chromatography and immunoprecipitation with antiphosphotyrosine antibody and its amino acid sequence was determined. The obtained N-terminal sequence, Val-Asn-Phe-Thr-Val-Asp-Gln-Ile-Arg-Ala- Ile-Met-Asp-Lys-Lys-Asn-Ile-Arg-Asn-Met-, was found to be identical to that of elongation factor 2 (EF-2) of both rat and hamster. Our results show that EF-2 in chick embryo is phosphorylated on its tyrosine residue and suggest the presence of other EF-2 kinase in chick embryo cells than the previously reported $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase III.
1911년 Rous가 닭의 육종 (sarcoma) 으로부터 sarcoma virus를 발견하였고 그 후 Erikson (1978)이 닭 육종의 원인 virus가 embryo fibroblast cell을 형질변환 시키는데 작용하는 src 암유전자 산물 ($p60^{v-src}$)이 단백질 인산화효소 (protein kinase) 활성이 있음을 최초로 보고하였다. 이 후 수년 뒤 Hunter등은 동일 단백질의 효소활성이 tyrosine 인산화효소임을 발견하였다.
단백질의 tyrosine 인산화 비율은 정상 동물세포에서 그 함량이 0.05% 이하로써 serine 혹은 threonine인산화 비율에 비하여 매우 낮다. 그러나 virus에 의해 형질변환된 세포 혹은 성장이 왕성한 태아세포등에서는 수십배 함량이 증가함이 알려져 있다. Tyrosine인산화되어 있는 단백질을 확인하는 방법은 $^{32}P$ 방사성 동위원소로 표지한 단백질시료를 SDS-전기영동한 후 이 gel를 55°C의 1 M KOH의 강알카리용액에서 2 시간 처리한 다음 강하게 방사능이 남아 있는 단백질 band을 찾거나 혹은 최근 개발된 phosphotyrosine 항체를 이용한 western blotting 및 immunoprecipitation 방법을 사용하는 것이 일반적이다. 그러나 최종적으로 발견된 단백질의 phosphoamino acid 조성을 분석하여 확인하는 것이 필요하다.
Tyrosine인산화가 알려진 이래 약 40여종의 tyrosine 인산화 효소가 발견되었으며 이 반응의 역할은 세포의 성장 및 분화를 조절하는 데 관여하고 있는 것으로 생각하고 있다. 이러한 추측은 PDGF (platelet-derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), insulin, IGF (insulin-like growth factor), CSF-1 (colony stimulating factor)등의 성장인자들의 수용체들이 모두 tyrosine 인산화효소 활성을 가지고 있으며 또한 세포의 형질변환을 유발하는 src, abl, fes/fps, fms등의 암화유전자 단백질들도 고유의 tyrosine 인산화 활성을 가지고 있다는 사실에 기초를 두고 있다. 성장인자들에 의하여 유발되는 신호전달계 (signal transduction system) 에서는 신호의 증폭을 위하여 tyrosine 인산화를 이용한 다단계 반응을 사용하고 있음을 예상 할 수 있다. 그러나 아직 확실한 이 반응의 기작은 잘 모르고 있다. 작용기작을 밝히기 위한 한 방법으로 tyrosine 인산화를 받는 세포에서 기능상 중요한 기질단백질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 알려진 중요한 기질단백질로써 phospholipase C-$\gamma$, Phosphatidylinositol (PI) kinase, GTPase activating protein (GAP), c-raf protein, Microtubule associated protein (MAP) kinase, $p34^{cdc2}$ 단백질들이 알려지고 있으나 이들 단백질이 tyrosine인산화에 의해서 활성이 변화되는 지 혹은 어떻게 조절되는지에 대한 직접적인 보고들은 아직 없다.
그러므로 본 연구에서는 성장이 왕성한 초기 닭배아세포에서 가장 높은 활성으로 tyrosine 인산화가 되는 새로운 기질단백질을 찾아 이 단백질의 기능과 생화학적 특성을 연구하고자 하였다. 배아세포는 무절제하게 분열하는 암세포와 유사한 특성을 가지고 있어 세포성장 및 분화의 기작등의 연구에 많이 응용되고 있다. 발육단계에 따른 tyrosine 인산화활성은 60 시간 근처의 배아세포에서 가장 높았으므로 이 단계의 배아세포 균질액을 [$\gamma-^{32}P$]ATP로 인산화 시킨 후 확인한 결과 분자량 95 KDa의 tyrosine 인산화 기질단백질 (95 KDa 단백질) 발견하였다. 따라서 tyrosine 인산화가 되는 단백질 가운데 유사한 분자량을 가진 것으로 그 특성이 잘 연구되어 있는 단백질은 insulin 수용체의 β-subunit 와 NCP94/$p94^{Fer}$ 가 알려져 있으므로 이들 단백질과 95 KDa 단백질을 insulin 수용체 항체, NCP94 항체 및 phosphotyrosine 항체를 이용한 immunoprecipitation 방법으로 $^{32}P$로 표지된 각 단백질들을 분리하여 peptide mapping 혹은 전기영동상의 band의 위치등으로 서로 비교하였다. 그 결과 95 KDa 단백질은 insulin 수용체 그리고 NCP94와는 서로 다른 단백질임을 알 수 있었으며 또한 이 사실은 95 KDa 단백질은 지금까지 알려지지 않은 tyrosine 인산화된 새로운 표적단백질 임의 가능성을 시사하는 것이 기도하다.
따라서 본 연구진은 닭배아세포의 균질액 단백질로부터 DEAE-Sephacel chromatography 및 phosphotyrosine 항체를 이용한 immunoprecipitation 방법으로 tyrosine 인산화된 단백질들을 침전시킨 후 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 tyrosine 인산화 95 KDa 단백질을 한 개의 단백질 band로 정제하였다. 정제한 95 KDa 단백질을 PVDF membrane 으로 이동 시킨 다음 자라내어 95 KDa 단백질의 N-말단 21 개의 아미노 산서열을 결정 하였다. 결정된 아미노 산 서열은 Val-Asn- Phe-Thr-Val-Asp-Gln-Ile-Arg-Ala-Ile-Met-Asp-Lys-Lys-Ala-Asn-Ile-Arg-Asn-Met- 이였다. 이 서열을 단백질 및 핵산서열 data bank를 이용하여 상동성이 큰 단백질을 조사한 결과 Hamster 및 rat의 elongation factor 2 (EF-2) 의 서열과 완전히 일치함을 알 수 있었다. 또한 95 KDa 단백질은 EF-2와 같이 cytosol에 존재하고 있으며 알려진 분자량과도 잘 일치하였다. 더우기 95 KDa 단백질은 EF-2와 마찬가지로 NAD 및 diphtheria toxin에 의하여 ADP-ribosylation됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 모든 결과로 부터 95 KDa 단백질이 EF-2임을 알게되었다.
지금까지 EF-2의 인산화에 대한 연구는 주로 토끼나 쥐의 reticulocyte lysate를 이용하여 수행되고 있으며 이 들 동물들의 EF-2는 분자 내의 threonine 잔기에 인산화되고 있음이 보고되고 있었다. 그러나 닭배아세포 EF-2는 threonine외 tyrosine 잔기에도 인산화 된다는 새로운 사실을 본 실험결과들로 부터 알 수 있었다. 이 밖에 EF-2 단백질은 상당히 안정한 분자이며 늦은시기보다 이른 발육단계에서 많은 량이 있음을 알 수 있었고 인산화활성은 60 시간의 발육시기에서 가장 높은 것을 관찰 되었다.
95 KDa 단백질 (EF-2)의 인산화효소 활성은 cytosol 및 particulate 분획에서 모두 확인 할 수 있었으나 후자에서 더 큰 활성을 측정 할 수 있었다.
앞으로의 인산화에 대한 조절기작의 연구를 위하여 90% 이상의 순도를 가지는 EF-2 (95 KDa 단백질)을 DEAE-Sephacel chromatography, CM-SEphadex C-50, Ultrogel AcA-44 gel filtration chromatograph을 이용하여 정제하였다.