$\underline{\mbox{Escherichia}}$ $\underline{\mbox{coli}}$ glutamine synthetase is specifically fragmented by nonenzymatic metal-catalyzed oxidation system comprised of dithiothreitol, $Fe^{3+}$, and molecular oxygen. Several characteristics of the cleavage reaction were investigated. Optimum intrinsic or extrinsc reaction conditions on the $\underline{\mbox{E}}$. $\underline{\mbox{coli}}$ glutamine synthetase cleavage were 5 mM dithiothreitol, 0.1mM $Fe^{3+}$, pH 7.0, 37℃, and 4 hour of reaction time when the enzyme concentration was 0.06mM as subunit basis. Three dimensional structure of the enzyme was required to the specific nonenzymatic cleavage producing polypeptide fragments with defined molecular weights. The cleavage patterns were dramatically changed by addition of inherent ligands. This indicates that the cleavage is occurred at the active site of the enzyme. Three major polypeptides were isolated from the reaction mixture and their amino acid compositions were determined. Based on the molecular weight and amino acid composition, it was found that 47.8 kDa, 33.3 kDa, 28.9 kDa polypeptide belongs to C-, N-, and C-terminal of $\underline{\mbox{E}}$. $\underline{\mbox{coli}}$ glutamine synthetase, respectively. Amino acid sequences of the isolated polypeptide revealed that 29.0 kDa polypeptide was a peptide containing N-terminal of $\underline{\mbox{E}}$. $\underline{\mbox{coli}}$ glutamine synthetase and the N-terminals of other polypeptides were blocked. Molecular weights of 33.3 kDa and 28.9 kDa polypeptides were re-estimated as 29.0 kDa and 22.0 kDa respectively, with the molecular weight markers produced from hydroxylamine cleavage. From hydroxylamine cleavage of the fragments, major cleavage sites were identified as around amino acid position 31 and around 260 which are located on protein constructing active site of the enzyme. Probable fragmentation sites of 103 and 356 were predicted from investigation of amino terminally blocked peptide. But major cleavage sites were not identified by the method. Remarkable new tryptic peptide was not produced from any of the isolated polypeptide fragments. Based on the results we concluded that the major nonenzymatic cleavages were occurred at the active site of $\underline{\mbox{E}}$. $\underline{\mbox{coli}}$ glutamine synthetase with the production of new blocked amino terminals. The major fragmentation sites were around 31 and 260 of amino acid in primary structure of $\underline{\mbox{E}}$. $\underline{\mbox{coli}}$.
대장균 글루타민 합성효소는 디티오트레이톨, 철 3 가 및 산소로 이루어진 비효소적인 금속촉매에 의한 산화 반응에 의하여 특이적으로 절단된다. 이 반응에 의한 단백질의 절단 부위를 확인하기 위하여 이 반응의 성질들에 대하여 실험하였다. 대장균 글루타민 합성효소의 절단반응의 최적 조건은 다음과 같았다. 효소단백질의 농도가 0.06 mM일 때 디티오트레이톨은 5 mM, 철 3가는 0.1 mM, pH 7.0. 온도 37℃ 그리고 반응시간은 4 시간이었다. 열변성시킨 효소에 대한 실험을 한 결과 일정한 분자량을 갖는 폴리펩타이드 절편을 생산하는 특이적 비효소적 절단에는 효소분자의 3차원적인 구조가 요구되었다. 이 반응에 의한 절단 양상은 이 효소에 고유한 기질등의 리간드 화합물의 첨가에 의하여 크게 변화되었다. 이는 이 절단 반응이 효소의 활성부위에서 발생함을 의미한다. 절단 반응 혼합물로부터 절단되어 생긴 주요한 단백질 절편 3개를 전기영동에 의하여 분리 정제한다음 이들의 아미노산 조성을 조사하였다. 이들의 분자량과 아미노산 조성으로부터 분자량이 47.8 kDa, 33.3 kDa, 28.9 kDa인 단백질 절편이 각각 이 효소 단백질의 C-, N- 및 C-말단 쪽임 알수 있었다. 단백질 절편들에 대한 N-말단기로 부터의 아미노산서열을 조사한 결과 33.3 kDa의 것이 이 효소의 N-말단을 함유함을 알았다. 다른 두 개의 폴리펩타이드 절편들은 N-말단이 봉쇄되어 있었다. 이들 단백질 절편들에 대한 히드록실아민에 의한 절단 실험 결과 47.8 kDa 과 28.9 kDa의 절편이 이 효소의 C-말단을 함유함을 알았다. 또한 히드록실아민에 의하여 절단된 대장균 글루타민 합성효소의 단백질 절편을 표준단백질로하여 이들 산화 절단되어 생긴 단백질 절편의 분자량을 다시 측정한 결과 33.3 kDa과 28.9 kDa의 절편이 각각 29.0 kDa 및 22.0 kDa임을 확인 하였다. 이들 실험결과 이 효소의 주된 절단 지점이 단백질의 서열중 31번과 260번 지점임을 찾아냈다. 그런데 이 지점들은 이효소의 활성부위를 지나는 7 개의 단백질 선분중 2 개에 위치하였다. 분리된 폴리펩타이드 절편에 트립신을 작용하여 비효소적으로 산화 절단된 지점을 포함한 새로 생긴 펩타이드를 찾아내 절단된 정확한 부위를 찾고자 하였으나 그러한 펩타이드를 찾을 수 없었다. 절단된 정확한 지점을 확인하기 위하여 분리된 단백질 절편을 트립신으로 가수분해하여 N-말단이 봉쇄된 펩타이드를 찾고자 하였지만 주요 절단 부위를 포함한 펩타이드는 분리되지 않았다. 이상의 실험을 통하여 디티오트레이톨, 철 3 가 및 산소로 이루어진 비효소적 산화 반응에 의한 대장균 글루타민 합성효소의 절단이 효소의 활성부위에서 발생하며 그 지점은 31 번과 260 번 지점 부근임을 알았다.
