The induction of protein methylase I preceded that of protein methylase III during in vivo immunizing period by SRBC and in vitro mitotic stimulation of splenic lymphocytes by lipopolysaccharide (LPS) and concanavalin A (Con A). The cellular protein methylation of arginyl and lysyl residues increased in proportion to the enzymes' activities. The methylation of these residues, and the proliferative, the polyclonal antibody and the T-independent antibody responses were markedly inhibited by sinefungin (SF) and 5'-deoxy-5'-S-isobutyl-adenosine (SIBA), two potent inhibitors of the enzymes. the Ki values of SF for the enzymes in vitro were lower than those of SIBA, however the cellular responses of the protein N-methylations and the immune responses (except T-independent response) were inhibited more sensitively by SIBA. Regardless of when added, SIBA immediately showed its effects on LPS-induced immune responses. The effects of SF were no longer observed when added later than the first 12 hrs in the 48 hrs experiment, however those of SF did not appear until 24 hrs after addition. These results showed that the rate-limiting factor to show its toxicity might be the step of transport into the cell.
Protein methylase I and III were assayed at indicated time during incubation of splenic lymphocytes with SF and SIBA. The enzymes activities in all tested groups were significantly inhibited by SIBA, but the enzymes activities were not inhibited by SF in cells harvested within 24 hrs after incubation in spite of higher inhibitory effect for the enzymes in vitro. This confirmed the hypothesis.
Therefore, the magnitude of inhibition by SF varied in proportion to the duration of incubation. That is, the effects of SF were lower than those of SIBA before 72 hrs of incubation, and the effects of SF increased so rapidly thereafter that LPS-induced immune responses were more potently blocked by SF. In this condition, it showed a correspondence between Ki value of SF and SIBA for the enzymes, and their inhibitory effects of LPS-induced immune responses. The correspondence suggests a possibility that the protein methylations by the enzymes paly a role in the stimulatory process of splenic lymphocytes.
To certify this correlation, the effect of cyclosporin A (CsA), a potent immunosuppressive agent, on LPS-induced immune response and the activity of protein methylase III were investigated. The polyclonal response and the activity of protein methylase III were inhibited by CsA in a very similar dose-dependent manner.
본 연구는 쥐 비장 세포의 protein methylase I과 III가 면역 반응에 어떻게 관여하는지에 관하여 조사하였다. SRBC에 의한 in vivo 면역과 LPS의 in vitro 자극에 의해 비장세포에 존재하는 protein methylase I과 III의 활성이 증가하였다. Protein methylase I의 증가는 비장세포의 증식 반응이 최대로 증가하는 시간이전에 최대로 증가하였으며, protein methylase III는 증식 반응이 증가한 지 24 시간이 경과되어서 증가하여 비장세포의 항체형성 반응이 증가하는 양상과 비슷하였다. 단백질의 arginyl 및 lysyl 잔기의 N-methyl화 반응은 세포내 protein methylase I과 III의 활성에 비례적으로 증가하였다.
Protein methylase I과 III가 면역 반응에 관여하는 지를 알기위해 그들의 억제제로 알려진 SF와 SIBA를 이용하였다. Protein methylase I과 III에 대한 SF의 $K_i$ 값은 SIBA의 $K_i$ 값 보다 적었으나 SF와 SIBA로 48 시간동안 노출된 비장세포의 protein methylase I과 III의 활성과 methyl 화 반응이 SIBA에 의해 더 저해되었다. LPS에 의한 비장세포의 증식과 항체형성 반응은 SF와 SIBA에 의해서 억제되었으며 그 정도는 methyl 화 반응의 억제와 유사하였다. SF와 SIBA의 면역 억제 작용이 protein methylase I과 III의 억제를 통해서 나타나는 것이라면 protein methylase I과 III에 대한 $K_i$값과 면역 기능의 억제정도가 일치해야 할 것인데 그렇지 못했다.
SIBA는 비장세포의 배양기간 (0 - 48 시간) 중 어느 때에 첨가되어도 억제 작용이 즉시 발휘되었으나 SF는 처음 12 시간 이내에서 투여할 경우에만 억제 작용을 보였고 그 정도도 낮았다. 아울러 배양 개시에 첨가된 SF는 배양 개시 24 시간까지 그 독성 작용이 전혀 나타나지 않았다. Lysyl 잔기의 N-methyl 화 반응은 MML이 먼저 형성된 후 DML 그리고 TML로 전환되는데 SIBA에 의해 세가지 형태의 methyl 화된 lysine 유도체의 형성이 50 % 정도 억제되었다. SF는 MML의 형성은 거의 저해시키지 않았으나 DML 경우는 53 %, TML 경우는 58 %를 저해시켜 늦게 일어나는 methyl 화 반응일수록 더 큰 저해 작용을 보였다. 이와 같은 결과에 의하면 SIBA의 억제 작용은 배양 기간 내 변동이 거의 없지만 SF의 작용은 배양 초기에서는 전혀 보이지 않다가 점차 증가하는 양상을 보였다. 배양 개시 72 시간 이후에서 비장세포의 증식 반응은 SIBA 보다 SF에 의해 현저히 저해되어서 protein methylase I과 III에 대한 $K_i$ 값과 일치된 양상을 보였다. 따라서 protein methylase I과 III의 억제를 통해서 비장세포의 면역 반응이 저해될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.
비장세포의 증식 반응에서 6.0 ㎍/ml의 Con A 농도는 supraoptimal 농도이었다. Supraoptimal 농도에서도 활성화 단계는 처리된 Con A의 농도에 비례적으로 증가하므로 배양 개시 24 시간에서 첨가된 Con A의 농도에 비례하여 활성이 증가된 protein methylase I 은 활성화 단계 ($G_0$ 에서 $G_1$ phase) 에 관계될 것으로 나타났다. 면역 저해제로 알려진 CsA에 의해 LPS에 대한 항체 형성 반응이 억제되는데 비장세포의 protein methylase III의 활성도 동일하게 감소되었다. 이는 protein methylase III가 항체 형성 단계 (S phase 후기에서 $G_2$ phase) 에 밀접하게 관련되어 있을 것으로 사료된다.
