Systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA) are autoimmune and complex diseases caused by multiple factors. Although many genetic factors are discovered, functional relationship between them and SLE or RA pathogenesis has been unclear. In this study, I set two goals: one was to find the novel loci associated with SLE susceptibility via genome-wide association study (GWAS). The other one was to discover gene-gene interactions and the mechanisms about how they affect SLE or RA susceptibility.
To identify novel genetic candidates for SLE in the Korean population, I analyzed the results of GWAS performed by our collaboration group (professor Sang-Cheol Bae in Hanyang University Hospital for Rheumatic Diseases) for 400 Korean female SLE patients and 445 controls. SNP rs9275428 located in HLA-DQA1 - HLA-DQA2 showed the strongest association with SLE (OR=0.50, FDR P-value = 3.07×10-6). Although no loci satisfied genome-wide significance outside MHC, 6 loci (C8orf13-BLK, STAT4, CSMD1, DIAPH3, GLDC, and TNFSF4) showed FDR P-values <0.05. Comparison among SLE GWASs including this study suggested that 6 SLE susceptible loci (STAT4, BLK, IRF5, PTTG1-miR-146a, UBE2L3, and TNFAIP3) are shared among Caucasians and Asians. In a combined analysis of 1,596 SLE patients and 2,540 controls, 16 candidate loci (PEX5L, TRAJ50, MYO18B, SOS1, ARHGAP26, SMURF1, CADPS, HAND1, FAM78B, DIAPH3, TBL1XR1, CSMD1, ZBTB20, C3orf21, HIPK1, and AP001042.1) showed only nominal significance (7.05x10-4 ≤ FDR P-values ≤ 4.38×10-2).
To discover gene-gene interactions to SLE susceptibility in a large Korean cohort (1,595 SLE patients and 2,534 controls), the 27 SNPs which had been reported in 6 SLE GWASs and satisfied the genome-wide significance (P-value < 1.0×10-08) were genotyped. 13 loci (TNFAIP3, STAT4, ETS1, RASGRP3, WDFY4, TNFSF4-PRDX6, TNFSF4, IKZF1, UBE2L3, TNIP1, BLK-c8orf13, IRF5-TNPO3, SLC15A4) were positively replicated (Adjustment with age and gender, 1.1x10-12 ≤ P-value ≤ 1.2x10-3). After that, 13 SNPs positively replicated in SLE were additionally genotyped in 1,135 RA patients and only 2 SNPs were also significantly replicated (Adjustment with age and gender; TNFAIP3 rs2230926 P-value = 4.0x10-3, STAT4 rs7574865 P-value = 8.9x10-5) with RA susceptibility. Subsequently, 13 SNPs associated with SLE or RA were tested for gene-gene interaction effect to SLE or RA susceptibility. TNFAIP3 - UBE2L3 interaction showed the strongest and synergistic effect (OR=1.54 P-value=2.9x10-03 in SLE, OR=1.41 P-value=3.6x10-02 in RA) to both SLE and RA susceptibility. In correlation analysis using TNFAIP3 and UBE2L3 mRNA expression of 179 HapMap individuals (From Genevar), their risk alleles were significantly associated with reduced TNFAIP3 (P-value=2.6x10-3) and increased UBE2L3 expression (P-value=7.3x10-8). Based on that negative regulator TNFAIP3 and positive regulator UBE2L3 are commonly implicated in TNFα-induced NF-κB signaling, I hypothesized that expression change of two genes would synergistically increase the NF-κB activity in TNFα signaling pathways. Therefore, p65 of NF-κB nuclear translocation upon TNFα stimulation was detected by western blotting in HEK293 cells, which were transiently transfected with combination of UBE2L3 overexpression vector or TNFAIP3 siRNA. UBE2L3 overexpression and TNFAIP3 knockdown synergistically increased NF-κB activity in HEK293 cells after 4hrs and 8hrs of TNFα treatment. Cytoplasmic TNFAIP3 in UBE2L3 overexpression cells was reduced compared to control cells. Sequential TNFAIP3 reduction by TNFAIP3 knockdown and UBE2L3 overexpression might cause the synergistic effect.
In conclusion, Caucasians and Asians show both similar and different genetic backgrounds to SLE susceptibility. In further research, larger samples are required to exclude the false positive loci among these 16 putative novel loci. TNFAIP3-UBE2L3 synergistic interaction to both SLE and RA susceptibility are positively validated via observation of synergistic increased NF-κB activity in TNFα pathway.
Keywords: Systemic lupus erythematosus (SLE), Rheumatoid arthritis (RA), Single nucleotide polymorphism (SNP), Gene-gene interaction
루푸스 (SLE) 와 류마티스관절염 (RA) 은 여러 인자들에 의해 유발되는 자가면역질환이다. 비록 많은 원인유전자들이 발굴되었지만 루푸스와 류마티스관절염의 발병 기작과 원인유전자들 사이의 상관관계는 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다. 나는 이번 연구를 통하여 두가지 목표를 세웠다. 첫번째는 유전체 전체 연관 연구법 (Genome-wide association study) 을 통하여 루푸스 감수성과 연관된 신규유전자를 발굴하고자 하였다. 다른 한가지 목표는 유전자-유전자 상호작용을 발굴하고 그 상호작용이 루푸스나 류마티스관절염 발병에 미치는 영향을 밝히고자 하였다.
한국인에서 루푸스와 연관된 신규 후보유전자들을 발굴하기 위하여 나는 공동연구팀 (한양대병원 류마티스내과 배상철 교수님) 에 의해 진행된 400명 한국인 루푸스환자와 445명 정상인 대조군들을 대상으로 한 전체 유전체 연관 연구법의 결과들을 분석하였다. HLA-DQA1 - HLA-DQA2 근처에 위치한 단일염기다형성 (SNP) rs9275428 은 가장 강한 루푸스 연관성 (OR=0.50, FDR P-value = 3.07×10-06) 을 보였다. MHC부위 밖에서 유전체 전체수준의 유의미한 기준 (P-value<1.1x10-8 )을 만족하는 유전체는 없었지만, 6개의 유전자들 (C8orf13-BLK, STAT4, CSMD1, DIAPH3, GLDC, and TNFSF4) 은 FDR P-values <0.05값들을 보였다. 이번 연구를 포함한 루푸스 유전체 전체 연관 분석결과들을 비교해 보았을 때 6개의 유전자들 (STAT4, BLK, IRF5, PTTG1 - miR-146a, UBE2L3, and TNFAIP3) 은 서양인들과 아시아인들 사이의 공통적인 루푸스연관 유전자들임을 알 수 있었다. 전체 샘플 (1,596명 루푸스 환자들과 2,540명 정상인대 조군들) 에서 16개 후보유전자들 (PEX5L, TRAJ50, MYO18B, SOS1, ARHGAP26, SMURF1, CADPS, HAND1, FAM78B, DIAPH3, TBL1XR1, CSMD1, ZBTB20, C3orf21, HIPK1, and AP001042.1) 이 오직 낮은 상관관계의 유의미함 (7.05x10-4 ≤ FDR P-values ≤ 4.38×10-2) 을 보였다.
루푸스 감수성에 영향을 주는 유전자-유전자 상호작용들을 발굴하기 위해, 이전 6개 루푸스 유전체 전체 연관 연구들에서 보고된 27개 SNP들이 1,595명 루푸스 환자들과 2,534명 정상인 대조군들 에서 분석되었다. 13개 유전자들 (TNFAIP3, STAT4, ETS1, RASGRP3, WDFY4, TNFSF4-PRDX6, TNFSF4, IKZF1, UBE2L3, TNIP1, BLK-c8orf13, IRF5-TNPO3, SLC15A4) 이 루푸스 연관성 (나이와 성별에 따른 차이를 보정하였음, 1.1x10-12 ≤ P-value ≤ 1.2x10-03) 에 대해 재현성이 검증되었다. 이후, 루푸스에서 검증된 13개 SNP을 1,135명 류마티스관절염 환자들에서 분석하였고 오직 2개 SNP들이 류마티스관절염 감수성과 연관 (나이와 성별에 따른 차이를 보정하였음; TNFAIP3 rs2230926 P-value = 4.0x10-03, STAT4 rs7574865 P-value = 8.9x10-05) 이 있었다. 이어진 루푸스 혹은 류마티스관절염과 연관이 있는 13개 SNP들을 대상으로 한 유전자-유전자 상호작용 분석에서, TNFAIP3-UBE2L3 상호작용은 루푸스와 류마티스관절염 감수성에 가장 강력한 시너지효과 (루푸스; OR=1.54 P-value=2.9x10-03, 류마티스관절염; OR=1.41 P-value=3.6x10-02) 를 보였다. HapMap project에 포함된 179명의 TNFAIP3와 UBE2L3 mRNA 발현 량 (Genevar 데이터베이스)을 이용한 상관분석에서, 각각의 위험 유전자형은 증가된 TNFAIP3 발현 량 (P-value=2.6x10-03) 과 감소된 UBE2L3 발현 량 P-value=7.3x10-08) 과 유의미한 연관성을 보였다. TNFR 신호전달 경로에서 TNFAIP3는 NF-κB 활성을 억제하고 UBE2L3는 반대로 NF-κB 활성을 증가시킨다는 사실을 바탕으로 두유전자의 발현 량 변화가 TFNR 신호전달 경로에서 NF-κB 활성을 시너지하게 증가시킬 것으로 예상하였다. UBE2L3 과 발현 벡터 또는 TNFAIP3 siRNA를 HEK293세포 내로 전달시킨 후, TNFα 자극에 따른 NF-κB의 p65가 핵으로 이동한 양을 Western blot을 이용하여 측정하였다. UBE2L3가 과 발현 되고 TNFAIP3가 저 발현되는 세포에서 TNFα 처리 4시간 과 8시간후에 NF-κB 활성이 시너지하게 증가되었다. UBE2L3가 과 발현된 세포의 세포질 안에 존재하는 TNFAIP3양은 대조군 세포에 비하여 감소되어있는 것을 관찰하였다. 따라서 TNFAIP감소와 UBE2L3 과 발현에 따른 TNFAIP3의 연속적인 감소에 의해 NF-κB 활성의 시너지한 효과가 생긴 것으로 생각 된다.
결론적으로, 서양인들과 아시아인들은 루푸스 감수성에 대해 유사한 유전적 배경과 동시에 다른 유전적 배경을 보였다. 추가적인 연구에서 16개의 후보유전자들에 대해 루푸스 연관성을 검증하기 위해서는 더 많은 샘플이 필요하다. 루푸스와 류마티스관절염 감수성에 미치는 TNFAIP3와 UBE2L3사이의 유전적 상승 상호작용은 TNFR 신호전달경로에서 NF-κB 활성이 시너지하게 증가되는 현상을 관찰함으로써 증명되었다.
핵심어: 루푸스, 류마티스관절염, 단일염기다형성, 유전자-유전자 상호작용
