The effects of the controlled water activity (Aw) of the reaction medium and the addition of polyethylene glycol(PEG) on enzymatic synthesis of cephalexin (CEX) from 7-amino-3-deacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) and D-$\alpha$ -phenylglycine methylester(PGM) using Xanthomonas citri enzyme were investigated. When the Aw of the reaction medium was depressed, the synthetic activity and conversion yield were markedly enhanced. Aw depressors used to control the Aw of reaction medium were sorbitol, sucrose and glycerol, and the enhancing effects on conversion yield were up to 270%, 230% and 170%, respectively. Aw depressors could also increase the enzyme stability to some extent, but this stabilizing effect was not related proportionally to the enhancing effects on conversion yield. These enhancements of conversion yield were probably resulted from the change of thermodynamic equilibrium and maximized at a range of Aw from 0.96 to 0.97. Based on the experimental results that show the decreasing of D-α-phenylglycine (PG, the hydrolysate of PGM and an inhibitor on CEX synthesis) accumulation rate in depressed-Aw system, it was noted that the conversion yield of CEX was enhanced due to the more sufficient PGM amount as an available substrate resulted from the suppression of the PGM hydrolytic reaction. With enzyme concentration of 0.5 unit/ml, it was possible to achieve sixfold reduction in necessary PGM amount to obtain the same yield as control by Aw depression of the reaction medium. And the addition of polyethylene glycol(PEG) to the reaction mixture also increased synthetic yield markedly, but did not affect PGM hydrolytic and CEX hydrolytic reaction rates. The concentrations of PEG used in these experiments could not depress water activity so significantly that water activity might affect the reaction system. PEG could also improve the stability of the enzyme, but this was not related proportionally to the enhancement of CEX synthetic yield as the case of Aw depression. A proposed mechanistic kinetic model was employed to describe the effect of PEG on cephalexin synthesis. In the presence of PEG, the dissociation constant for 7-ADCA, $K_{7-ADCA}$, was smaller than that in control system without PEG addition and the simulation results on CEX synthesis fitted well the experimental data both in control and PEG system, suggesting that the addition of PEG enhanced cephalexin synthesis by increasing the affinity between enzyme and 7-ADCA. The enhancing effect of PEG increased with increasing of the length of poly(oxy-1,2-ethanediyl) chain in PEG molecule, which consequently lead to the conclusion that the hydrophobicity of PEG chain structure might affect the affinity between enzyme and substrate. Controlled feeding of PGM enhanced the CEX synthetic yield to some extent at low enzyme concentration as a result of PG accumulation. In case of enzyme immobilization on bentonite, the conversion yield was increased by 50%, but the enzyme was seriously deactivated during the repeated use.
Xanthomonas citri의 효소를 이용한 반합성 항생제 cephalexin의 생합성 반응계에서 인위적으로 조절된 반응계의 물리화학적 특성이 cephalexin 합성에 미치는 영향을 조사하고 반응 기작을 분석하였다. 합성반응계의 물리화학적 특성은 수분 활성도 억제제의 첨가, polyethylene glycol(PEG)의 첨가, 기질 PGM의 간헐적 혹은 연속적 공급, 효소 고정화등의 방법으로 그 조절을 시도하였다.
1. Cephalexin합성반응외에도 PGM가수분해 반응과 cephalexin가수분해 반응을 동시에 촉매하는 효소 반응기작의 특성을 감안하여 수분활성도를 감소시킨 합성 반응계애서 cephalexin의 합성 수율에 대한 상당한 정도의 증대효과가 나타났다. 사용된 수분활성도 억제제 중에 가장 좋은 효과를 보인 것은 sorbitol로서 270%의 상승효과가 있었으며 sucrose와 glycerol이 나타낸 상승효과는 각각 230%와 170%였다. 각 억제제에 대해 나타난 cephalexin합성수율증대에 대한 최적 수분활성도는 모두 0.96-0.97의 범위에 위치함으로써 이 상승효과는 반응계의 수분활성도라는 물리화학적 변수에 의해 영향받고 있음을 뒷받침해 주었다. 최적치 (0.96) 이하의 수분활성도에 서 효과가 오히려 감소하는 경향은 수분활성도 억제제 첨가에 따르는 반응계 점도의 증가, 즉 물질전달현상의 저해와는 무관하였으며, 그 기작은 불분명하나 억제제가 효소분자의 촉매 작용 자체에 영향을 끼치는 것으로 생각되었다. 효소의 안정성 또한 수분활성도 억제제의 첨가로 인해 증대됨을 보여 cephalexin합성 수율의 상승에 부분적으로 관여하는 것으로 나타났으나 직접적인 원인은 되지 못함을 알 수 있었다. 반응계의 수분 활성도 조절은 cephalexin분해 반응에는 전혀 영향을 주지 못하였으며 PGM의 가수 분해 반응을 저지하는 것으로 밝혀졌다. Cephalexin의 합성중에 일어나는 PG의 축적 현상을 추적한 결과 조절된 수분활성도하에서는 PG의 생성이 지연되며 따라서 기질로 유용한 PGM의 잔여 농도가 높게 유지됨으로써 cephalexin의 합성수율이 증대되는 것임을 알게되었다. 이러한 효과에 근거하여 수분활성도가 조절된 합성 반응계에서 1/6 수준까지 PGM의 사용량을 절감할 수 있었다.
2. 반응계에 첨가된 PEG역시 cephalexin의 합성 수율을 상당한 정도로 증가시켰다. 증대효과는 PEG의 분자량이 커짐에 따라 더욱 높아졌으나 PEG 20000 의 경우는 반응계의 점도가 지나치게 높아져 물질전달 현상에의 저해작용이 있었다. PEG는 cephalexin 가수분해와 PGM 가수분해 반응 모두에 대해 저지 작용이 없었으며, 수분활성도 억제제의 경우와 같이 효소의 안정성에는 증대효과를 보였으나 이 역시 합성수율 상승효과에 대해 일차적인 요인은 되지 못하였다. PEG에 의해 물리 화학적 특성이 변화된 반응계에 대해 kinetic model을 이용한 속도론적 분석을 수행한 결과, 추정된 상수값과 model식으로 부터의 simulation결과와 실험치가 잘 일치함을 알 수 있었고, 비 친화력 상수 $K_{7-ADCA}$가 감소됨으로부터 PEG효과는 효소분자와 7-ADCA의 친화력을 높이는 작용에 기인함을 추측할 수 있었다. 또한 PEG의 분자량과 PEG효과와의 일차적 비례관계가 밝혀짐으로써 PEG의 그러한 작용은 PEG분자내 비친수성 poly(oxy-1,2-ethanediyl) 쇄상구조가 행하는 것으로 나타났다.
3. PGM 가수분해 산물인 PG 의 저해작용을 피하기 위해 고안한 PGM 연속공급에 의한 합성반응계에서는 낮은 효소농도에 대해서 cephalexin으로의 전환수율이 상승하는 효과가 있었다.
4. 물리적 흡착법에 의한 bentonite에의 효소 고정화는 효소 단백질에 대해 특이하게 효율적이었으며 제조된 고정화 효소를 이용한 cephalexin합성 수율역시 증가하였으나 안정성 문제로 반복사용에는 부적당하였다.
