The chromosomal DNA from Streptococcus equisimilis ATCC 9542 was cloned in E. coli HB101 by using the plasmid vector pBR 322. A casein/plasminogen overlay technique was used to screen the gene bank for recombinants carrying the streptokinase gene. The gene was present with a frequency of 1 in 460 recombinants, and 26 independent clones containing streptokinase gene were isolated and physically characterized. One recombinant clone (pSK II) was used to subclone in M13 phage and site-directed mutagenesis was carried out to replace Gly 24 residue with histidine, glutamic acid, and alanine. The mutated streptokinase genes were expressed in E. coli C600 using the tac promoter and the streptokinases were purified by ammonium sulfate fractionation DEAE-cellulose, and Sephadex G-150 chromatography. The active fractions were detected using dot immunoblot assay of eluate. The plasminogen activator activity of the purified streptokinases was determined. Wild-type streptokinase and alanine mutant streptokinase were found to be active as plasminogen activators. The activity of alanine mutant streptokinase was somewhat less than that of wild-type, and histidine mutant streptokinase and glutamic acid mutant streptokinase showed activities only 4% and 3%, respectively, of the activity of wild-type. A modified radioimmunoassay method was used to detect streptokinase bound to the human plasminogen coated on the wells. The radioactivity increased and saturated with increasing streptokinase concentration, indicating normal binding of the streptokinases with human plasminogen. The results indicate that the small, uncharged alkyl group side-chain on the 24th amino acid residue of streptokinase is indispensable for the activity of the human plasminogen-streptokinase complex.
Streptococcus equisimilis ATCC 9542로부터 Chromosomal DNA를 分離한 후 Pst I 으로 切斷하여 Plasmid pBR322에 連結한 뒤 E. coli에 注入시켜 스트렙토카이네이즈의 活性을 보이는 細胞群을 選別하였다. 약 12,000 개의 細胞群으로부터 스트렙토카이네이즈의 活性을 보이는 26 개의 細胞群을 選別하여 스트렙토카이네이즈의 遺傳子를 分析하였다. 스트렙토카이네이즈의 遺傳子를 M13 파아지에 連結하여 Gly24 部位를 Alanine, Glutamic acid, Histidine 으로 置換시키는 부위특이 突然變異를 행하였다. 突然變異된 스트렙토카이네이즈의 遺傳子를 그 자체의 Promoter 와 tac promoter 를 이용하여 각각 發現시켜 그 活性을 比較하였다. tac promoter 로부터 發現된 스트렙토카이네이즈를 황산암모늄 分劃法, DEAE 이온 交換樹脂, 젤 濾過法 등을 이용하여 純粹 分離하였다. 活性이 없어진 스트렙토카이네이즈를 分離精製하기 위하여 Dot immunoblot assay 法이 이용되었다. Alanine 突然變異 스트렙토카이네이즈가 플라스미노젠을 活性화 시키는 力價는 野生型의 스트렙토카이네이즈 力價에 比해 85% 정도였으며 Histidine 이나 Glutamic acid 突然變異 스트렙토카이네이즈는 野生型에 比해 각각 4%, 3% 의 力價를 지니고 있는 것으로 觀察되었다. Radioimmunoassay 법을 변형, 野生型과 突然變異 된 스트렙토카이네이즈에 대하여 플라스미노젠과의 結合反應을 調査하였다. 스트렙토카이네이즈의 濃度가 增加함에 따라 放射線 量이 增加하고 飽和狀態에 이르는 것으로 보아 사람의 플라스미노젠과 正常的으로 結合하고 있음을 알 수 있었다. Glutamic acid나 Histidine 突然變異 스트렙토카이네이즈가 플라스미노젠과 正常的으로 結合을 하면서도 活性化 시키지 못하는 理由는 스트렙토카이네이즈가 突然變異에 의해 플라스미노젠과의 結合部位에 3次元構造의 變化가 생겨 活性化에 必要한 orientation 을 하지 못하기 때문으로 생각된다. 이 實驗으로써 스트렙토카이네이즈는 24번째 아미노산의 側鎖가 疏水性이면서 그 크기가 작은 것 이어야 活性을 維持함을 알 수 있었다.
