Acetylation of ε-amino groups of lysine residues changed conformation of glycinin isolated from soy bean, the extent of which depended upon the degree of modification. Soy glycinin with lysine residue modifications of 0%, 28%, 65%, 85%, and 95% were used for the experiment. Accessibility of tyrosine and tryptophan residues, which were shown to increase as modification percent increased, were detected using uv absorption spectra and fluorescence spectra, respectively. Surface hydrophobicity was found to increase more than times over native glycinin when lysine residues were excessively modified to above 95%. Masking of charged lysine residues, exposure of hydrophobic interior, and subunit dissociation should have contributed to the increase. Enthalpy, as obtained from differential scanning calorimetry, dropped from 3.6 cal/g native protein to 0 cal/g protein when lysine residues were acetylated above 65%, implicating complete denaturation. The hydrolytic rates, using α-chymotrypsin, increased initially, then decreased at more than 65% lysine modification.
Effect of the acetylation on turbidity of protein was investigated using samples of 0%, 65%, and 90% acetylation. Turbidity of acetylated glycinin decreased and isoelectric point shifted to acidic region. Salts (NaCl, $CaCl_2$) were found to hardly affect turbidity of acetylated glycinin in contrast to native one. Sodium chloride depressed turbidity of native protein while that of 90% modified sample was scarcely changed. Calcium chloride dramatically increased turbidity of native protein at above pH 7, while that of 90% modified glycinin was hardly affected. Heat stability of glycinin was found to increase by acetylation. Conglycinin affected little on turbidity of acetlylated glycinin in contrast to the native protein.
Emulsfying properties of acetylated glycinin was also checked using samples of 0%, 45%, and 90% modification. At oil to protein solution ratio of 2.5:7, pH 7.6, 90% acetylated glycinin showed over 70% increase in emulsion activity over native protein. At above isoelectric point of the protein, emulsifying properties of acetylated protein was superior to that of native protein. But below the isoelectric point, native glycinin showed better emulsion activity. Emulsion stability of the glycinin was significantly improved by acetylation. Effects of some salts, such as NaCl $CaCl_2$ β-mercaptoethanol, were also checked. Incubation with glucose reduced solubility of the protein, the extent of which was greatest for the native protein. Emulsion activity was found to be the lowest for the native protein incubated with glucose.
In this experiment, factors affecting functionalities of protein, in terms of physicochemical properties, were investigated. Thus the aim of this study was to assess the possibility of applying the basic understanding of protein to improve such functionalities as turbidity and emulsifying activity.
콩의 주요 저장 단백질인 glycinin의 라이신잔기를 적당량의 acetic anhydride 를 이용하여 28%, 45%, 65%, 95% 로 아세틸화 시켰다. 아세틸화에 의한 glycinin의 구조적 변화를 UV 흡광법, 이차미분 분광기, 형광 분광기를 이용하여 측정한 결과, 타이로신 잔기는 자연상태의 단백질에 있어서는 약 40% 가 단백질 표면에 노출되어 있었으나, 95% 아세틸화 glycinin 에 있어서는 70% 이상이 표면에 노출되어 용매에 대해 접근이 용이하게 되었다. 타이로신과 같은 소수성 아미노산인 트립토판 역시 아세틸화에 따른 단백질의 구조 변형에 의해 점차 단백질의 소수성 내부로부터 친수성 표면으로 이동하였음을 알 수 있었다. 단백질의 기능적 특성에 특히 중요한 물리화학적 성질중 표면 소수성 (surface hydrophobicity) 과 유연성 (flexibility) 은 자연 상태의 단백질에 있어서는 80 정도였으나, 아세틸화가 95% 일어난 단백질에 있어서는 180 으로 2배 이상 증가 하였으며, 유연성은 유연성과 역관계에 있는 엔탈피를 측정한결과 자연상태의 단백질에서는 3.5 cal/g 단백질 에서 65% 아세틸화 이상의 단백질의경우에는 0 cal/g 으로 유연성이 급속히 증가함을 알 수 있었다. Circular dichroism 의 결과 아세틸화에 의해 단백질의 β-형태가 감소하고 풀린형태가 증가하여 나타나는 현상임을 알 수 있었다.
아세틸화에 의해 단백질의 pH 에따른 혼탁도는 산성쪽으로 이동하였으며 혼탁도 정도는 자연상태의 glycinin에비해 현저히감소하였다. 혼탁도가 나타나는 pH의 이동과 감소는 각각 아세틸화에의해 ∈-아미노기에 대한 전하가 +1 에서 0으로 되었기 때문이며 단백질간의 응집의 주된 힘이 수소결합에서 소수성 결합으로 바뀌었기 때문이다. NaCl 은 자연상태의 glycinin 의 혼탁도를 낮추었으나 화학적 변성이 일어난 glycinin 에 있어서는 그영향이 현저히 감소하였다. 칼슘은 pH 6 이상에서 자연상태의 단백질에 있는 이미다졸기와 반응하여 혼탁도를 유발 하였으나 아세틸화 단백질에 대하여서는 별다른 영향을 미치지 못하였데 이는 화학적변성에의해 glycinin의 구조가 변화하여 칼슘이온과의 결합이 이루어지지 않기때문이다. 아세틸화 단백질은 열에 대하여 안정성을 나타 내었으나 자연상태의 단백질은 80 ℃ 에서 3분간 가열처리에 의해 급속히 혼탁되었는데 이는 아세틸화에의해 glycinin의 음전하가 상대적으로 증가하여 단백질간의 반발력이 증대 되었기 때문에 나타나는 현상이다. 또한 자연 상태의 glycinin 은 conglycinin에 의해 열안정성을 보였으나 아세틸화에 의해 음전하가 상대적으로 증가한 glycinin은 conglycinin의 소단위체에 의한 열안정화가 상실되어 혼탁도의 상대적인 증가현상이나타났다.
에멀션화에 관한 실험에 의해 아세틸화가 이루어진 glycinin 은 자연상태의 glycinin 에비해 등전점 이상의 pH에서는 보다 높은 활성도를 나타냈는데 이는 아세틸화에 의해 단백질의 표면 소수성과 유연성이 증대되었기 때문이다. 그러나 등전점 이하에서는 자연상태의 단백질이 아세틸화된 단백질에 비해 상대적으로 높은 에멀션 활성도를 나타내었으며, 이는 자연상태의 glycinin 이 이 구간에서는 보다 높은 용해도를 나타내었기 때문이라 생각된다. NaCl 과 β-mercaptoethanol 은 pH 7.5 에서 자연상태의 단백질의 에멀션 활성도를 향상시켰으나 아세틸화 단백질에 대해서는 이러한 특성이 나타나지 않았다. NaCl 과 β-mercaptoethanol 은 자연상태의 glycinin 의 용해도와 유연성을 증대시키나 아세틸화 단백질은 이러한 영향을 받지 않기 때문에 나타나는 현상이라 생각된다. 한편 칼슘 이온은 자연상태의 glycinin 의 용해도를 급속히 낮추므로 에멀션 활성도의 급속한 저하를 가져왔으나 아세틸화 단백질에 대하여서는 용해도에 별다른 영향을 미치지 못하므로 에멀션 활성도의 감소는 상대적으로 적었다. 아세틸화 glycinin 에 의해 생성된 에멀션은 자연상태의 glycinin 에 의해 형성된 에멀션에 비해 현저히 높은 안정도를 보였다. 아세틸화에 의해 glycinin 의 음이온이 상대적으로 증가하여 정전기적인 반발력의 증가와 수성계의 점도 증가에의해, 기름 방울간의 모임이 억제되어 에멀션의 안정도가 증대 되었다고 생각된다. 갈변화 반응은 아세틸화가 일어난 glycinin 일수록 적게 일어났으며 따서 용해도의 감소 역시 자연상태의 단백질에 비해 적었다. 따라서 에멀션 활성도의 감소는 아세틸화가 일어난 glycinin 이 가장 적었으며, 자연상태의 단백질이 가장 컸다. 이상에서 본바와 같이, glycinin 에 대한 아세틸화에 의해 glycinin의 구조는 급속히 변성되었으며, 특히 65% 이상에서는 그 변화 폭이 급격히 이루어 졌다.
이상에서 살펴본 바와 같이 아세틸화가 이루어 진 단백질의 기능적 특성 중 특히 혼탁도와 에멀션 활성도의 향상은 전화의 이동과 단백질이 구조적 변성, 특히 표면 수소성과 유연성 의 변화에 의해 기인함이 밝혀졌다.
