In this thesis, the content will be classified into two main parts ; (1) molecular cloning and sequence analyses of cDNA coding for canine gastrin, (2) studies on the DNA protection by type II restriction and modification enzymes.
For the first part, cDNA encoding the precursor of canine gastrin was cloned. The full length cDNA sequence has been determined by overlapping the partial gastrin sequences of the two cDNA clones, pDG 1917 and pDG 1647. The nucleotide sequences of the two cDNA clones, pDG 1917 and pDG 1647. The nucleotide sequence of the combined cDNA insert (446 nucleotides) revealed 315 nucleotides in the entire mRNA coding region, 49 nucleotides in the 5'-untranslated region and 82 nucleotides in the 3'untranslated region. Comparison of this sequence with those of porcine, human and rat gastrin reveals extensive (83%) homology in the gastrin coding region as well as short regions of conserved nucleotides in the noncoding regions. The canine sequence encodes a preprogastrin of 104 amino acids which consists of a signal peptide, a 37 amino acid prosegment, and the gastrin 34 sequence, followed by a glycine (the amide donor), and flanked by pairs of arginine residues. Cleavage at an internal pair of lysine residues yields gastrin 17. A considerable homology between the deduced amino acid sequence of canine precursor and that from other mammalian species has been found; the canine sequence shows 85% homology with porcine gastrin, 79% homology with human gastrin and 75% homology with rat gastrin.
For the second part, the DNAs methylated by central tetranucleotide specific methylases (Alu I, Hpa II, Hha I) were resistant against cleavages of related hexameric endonucleases indicating that the methyl group of the C5 position of the inmost cytosine nucleotides interferes with the interaction between the enzymes and the hexameric recognition sequences. The results imply that one can predict the specificities of the related hexameric methylases which have not been isolated yet. When treated with Hind III endonuclease, the DNA modified (even though the modification was not Hind III specific methylation) by Alu I methylase was partially cleaved, indicating that the methylated cytosine residue inhibits the proper interaction between the Hind III site and Hind III endonuclease. From the similar result obtained with Sst I endonuclease, we can conclude that the specific methylation of Sst I methylase (which has not been isolated yet) would not be the same as Alu I methylase. In the case of Pvu II and Sac I endonucleases, none of the enzymes could cleave the DNA methylated by Alu I methylase. These results could be the strong evidence that the specific methylations of Pvu II and Sac I methylases (these enzymes have not been isolated yet) are the same as Alu I methylase. However, it can not be ruled out that a methylation near the recognition sequence can have the same effect as the specific methylase upon cleavage of the cognate endonuclease.
When treated with Sma I, Ava I and Nae I endonucleases, the DNA methylated by Hpa II methylase was totally resistant against the cleavage reactions. These results could also be the strong evidences that the specific methylation sites of Sma I, Ava I and Nae I methylases which yet to be isolated are the same as the case of Hpa II methylase. In contrast to Sma I, Ava I and Nae I endonucleases, Xma I endonuclease could cleave the DNA modified by Hpa II methylase although the reaction rate was considerably decreased. This result indicates that the methylated cytosine residue inhibits the proper interaction between Xma I endonuclease and its recognition sequence. This result also implies that the specific methylation site of Xma I methylase, which has not been isolated yet, would not be the same as the case of Hpa II methylase.
The DNA methylated by Hha I methylase was not cleaved by Hae II or Aha II endonuclease but cleaved normally by Ban I endonuclease. The fact that Hae II or Aha II endonuclease can not cleave the DNA methylated by Hha I methylase can be explained by one of the following two resons. (1) Within the hexameric Hae II or Aha II sequence, the specific methylation site of Hae II or Aha II methylase (which is yet to be isolated is identical) with the site of Hha I methylase. (2) DNA methylation within the hexameric Hae II or Aha II sequence by Hha I methylase can inhibit Hae II or Aha II endonuclease reaction even though the methylation site is different from the site of the cognate restriction methylase. In contrast to Hae II or Aha II endonuclease, Ban I endonuclease can recognize and cleave its hexameric sequence even after the methylation by Hha I methylase. Considering the fact that the thymidine nucleotide of 5'-GGTACC-3' or 5'-GGTGCC-3' has already methyl group on C5 position of the pyrimidine ring and Ban I endonuclease has four specific sequence, 5'-GGCGCC-3', 5'-GGCACC-3', 5'-GGTGCC'3' and 5'-GGTACC-3' it is expected that the methylation on the inmost cytosine nucleotide of 5'-GGCGCC-3' by Hha I methylase would not interfere with the specific interaction between Ban I endonuclease and its recognition sequence.
본 학위논문의 내용은 크게 두부분으로 나누어진다. 그 전반부에서는 개의 가스트린 유전자의 cDNA 합성과 염기서열에 관한 분자생물학적 연구에 대하여 기술하였으며, 후반부에서는 Type II 메틸화 효소에 의한 DNA 보호효과에 대하여 기술하였다.
먼저 전반부의 내용을 요약하면, 개의 위점막세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 cDNA 은행 (bank) 을 만들고 이로부터 가스트린 유전자를 갖는 재조합 플래스미드를 분리하였다. 이 유전자의 염기서열은 두개의 플래스미드 (pDG 1917 과 pDG 1647) 로 부터 결정되었으며, 전체길이는 446 염기쌍이었다. 이것은 315 염기쌍의 번역지역, 49 염기쌍의 5' 쪽의 비 번역지역, 3'쪽의 비 번역지역으로 나누어진다. 개, 사람, 돼지, 쥐 등의 가스트린 cDNA 염기서열을 서로 비교해 보면 번역지역은 83% 의 염기서열 유사성을 보이며, 비번역지역도 부분적으로 염기서열이 잘 보존된 곳을 발견할 수 있다. 개의 가스트린 RNA는 104개의 아미노산 사슬로 번역되며, 이 아미노산 사슬은 signal 펩타이드, prosegment, 가스트린 34 등으로 구성된다. 가스트린 34는 내부의 Lysine 잔기의 쌍이 절단되어 가스트린 17 을 만든다. 개와 다른 포유동물의 가스트린 전구체사이에서도 아미노산 사슬에서 상당한 유사성을 보이는데, 즉 개와 돼지 사이에는 85%, 개와 사람 사이에는 79%, 개와 쥐 사이에는 75% 의 유사성을 각각 보이고 있다.
후반부의 내용을 요약하면, 4개의 염기서열을 특이적으로 인식하여 메틸화 시키는 효소에 의하여 변형된 DNA는 중앙 4개의 염기서열을 포함하여 6개의 염기서열을 인식하는 제한효소의 절단반응에 대하여 보호효과를 보인다. 이것은 내부 cytosine 염기의 C5 위치의 메틸화된 부위가 제한효소와 변형된 DNA와의 상호작용을 방해하기 때문이다. 이러한 결과로 부터 간접적이지만 6개의 염기서열을 인식하여 변형하는 메틸화 효소 (동종의 제한효소는 같은 염기서열을 인식하여 변형되지 않은 DNA를 절단함) 의 몇가지 특이성을 유추할 수 있다.
Alu I 메틸화 효소로 변형된 DNA를 Hind III 제한효소로 처리하면, 부분적인 절단반응만 일어나는데 이것은 변형된 cytosine 잔기가 DNA의 Hind III 제한효소의 인식부위와 Hind III 제한효소 사이의 적합한 상호작용을 방해하기 때문이다. 비슷한 결과가 Sst I 제한효소의 효소활성에서도 나타난다. 이로부터 Hind III, Sst I 메틸화효소 (이 효소들은 아직 발견되지 않았다.) 의 메틸화 부위는 Alu I 메틸화효소와는 같지 않을 것이라고 결론내릴 수 있다. 똑같은 방법으로, Alu I 메틸화효소로 변형된 DNA를 Pvu II 와 Sac I 제한효소로 처리했을때 전혀 절단할 수 없음을 발견하였다. 이것은 Pvu II 와 Sac I 메틸화효소 (이 효소들도 아직 발견되지 않았다.) 의 메틸화 부위가 Alu I 메틸화효소의 메틸화 부위와 같을 것 이라는 강력한 증거가 된다. 그러나 인식부위 근처의 다른 곳이 메틸화 되어 똑같은 보호효과를 나타낼 수 있다는 가능성을 배제할 수는 없다.
Hpa II 메틸화효소에 의해 변형된 DNA를 Sma I, Ava I, Nae I 등의 제한효소로 처리했을 때에도 그 절단반응이 완전히 저해됨을 알 수 있다. 이것은 위에 열거한 메틸화효소들이 Hpa II 메틸화효소와 같은 부위를 메틸화시킬 것임을 강력히 시사한다. 이와는 대조적으로, Xma I 제한효소는 변형된 DNA를 부분적으로만 절단할 수 있다. 이것은 Hpa II 메틸화효소에 의해 변형된 DNA의 cytosine 잔기가 Xma I 제한효소와 그 효소의 인식부위 간의 적합한 상호작용을 방해할 뿐 아니라 Xma I 메틸화효소가 장래에 발견된다면 Hpa II 메틸화효소와 다른부위를 메틸화 시킬 것임을 나타낸다.
Hha I 메틸화효소에 의해 변형된 DNA를 Hae II, Aha II, Ban I 등의 제한효소로 처리하면, Hae II 와 Aha II 제한효소에 의해서는 전혀 절단되지 않지만 Ban I 제한효소에 의해서는 정상적으로 절단됨을 발견할 수 있다. Hae II 와 Aha II 제한효소가 Hha I 메틸화효소에 의해 변형된 DNA를 전혀 절단할 수 없다는 사실은 다음 두가지 중의 하나로 설명할 수 있다. 첫번째로 Hae II 와 Aha II 메틸화효소 (이 효소들은 아직 발견되지 않았다.) 의 메틸화 부위가 Hha I 메틸화효소의 메틸화 부위와 같을 경우이며, 두번째로 Hae II 와 Aha II 메틸화효소의 메틸화 부위가 Hha I 메틸화효소의 메틸화 부위와는 다르지만 동종의 제한효소 반응에서는 똑같은 보호효과를 보이는 경우이다. 이와는 대조적으로 Ban I 제한효소는 Hha I 메틸화효소에 의해 변형된 DNA를 정상적으로 절단할 수 있다. 이것은 그 인식부위인 5'-GGTACC-3' 과 5'-GGTGCC-3'내의 thymidine 잔기가 pyrimidine 환의 C5 위치에 이미 메틸기를 갖고 있으며, Ban I 제한효소의 인식부위가 5'-GGCGCC-3', 5'-GGCACC-3', 5'-GGTGCC-3', 5'-GGTACC-3' 등의 네가지인 점을 고려해 볼 때 Ban I 제한효소가 Hha I 메틸화효소에 의해 변형된 DNA라도 아무 상관없이 절단할 수 있을 것으로 미리 예견할 수 있었다.
