Three forms of inulase were purified from $\underline{Aspergillus}$ $\underline{niger}$ by ultrafiltration, DEAE-Trisacryl chromatography, Sephadex G-150 gel filtration, and preparative isoelectric focusing. The isoelectric focusing resolved inulase into three peaks with isoelectric points of 4.5, 4.9 and 5.2. Among them, peaks II and III were purified to homogeneity as a single band on an analytical isoelectric focusing gel. These peaks represented glycoproteins with similar molecular weights, about $3×10^5$ and appeared to consist of four identical subunits. On the basis of molecular weight, subunit, amino acid analysis, chemical modification, and fluorescence spectrum, the overall molecular characteristics of the three forms were similar. However, the three forms exhibited distinctly different kinetic constants. The enzyme splits β-2, 1-linkage of sucrose and straight chain oligoand polyfructosides of the inulin type, by endwise removal of fructosyl units.
A exo-inulase (β-D-fructofuranoside fructohydrolase, EC 3.2.1. 26) from $\underline{Bacillus}$ $\underline{subtilis}$ was partially purified, and its mode of action and general properties were studied. The enzyme had an apparent molecular weight of 49,000 as estimated by gel filtration. Its isoelectric point was 5.2. The enzyme was acid-labile, and had a optimum pH of 6.6. The optimum temperature was 50℃. Kinetic studies showed an apparent Km of 18 mM for sucrose and 25 mM for raffinose. The enzyme degraded sucrose and chain oligoand polyfructosides of the inulin type by endwise removal of fructosyl units.
이눌린은 과당이나 에타놀을 생산하는데 중요한 biomass의 자원으로알려져 있다. 본 실험에서는 이 이눌린을 분해시키는 한 미생물로 부터 이눌라아제를 분리 정제하고 그의 생화학적 특성이 조사되었다.
Aspergillus niger M79가 분비하는 이눌라아제가 한외 여과, DEAE-Tris-acryl, Sephadex G-150, 등전점 초점화 방법에 의해 정제되었다. 등전점 초점화에 의해 이눌라아제는 세 종류의 등전점 (Form I, 4.5; II, 4.9;III, 5.2) 을 가지는 효소들로 구성되어 있었고 그 중에서 III형은 전체 이눌라아제의 50% 정도 활성을 가지고 있는 주된 단백질이었다. 이들 중 II와 III 형은 분석 등점 초점화에 의해 단일 밴드로정제됨을 확인 할 수 있었으나 I 형은 HPLC에 의한 정제가 더 필요하였다. 이들은 4 개의 동일한 subunit 를 가지는 분자량 약 300,000 의 당단백질로서 아미노산의 함량 분석 결과는 세 효소의 아미노산 함량 비율이 대단히 유사함을 보여 주었다. 또한 트립토판 형광 스펙트라로 부터 세 효소들의 emission spectra는 $λ_max$가 2nm씩 전이 됨을 알 수 있었다. 이는 세 효소의 tryptophanyl 기가 친수 지역으로의 노출 정도가 각각 다르다는 것을 보여준다. 이 효소들의 이눌린에 대한 작용 모드가 HPLC에 의해 조사되었다. 이눌린과의 반응 초기 단계에서는 일정한 비율로 과당이 생성되었고 다른 생성물은 검출되지 않았으나 반응이 계속 진행됨에 따라 포도당이 생성되기 시작함을 관측 할 수 있었다. 이는 이효소들의 작용 기작이 이눌린의 fructosyl 끝 말단으로 부터 β-2,1 결합을 순차적으로 잘라가는 exowise cleavage mode 임을 보여준다. 효소의 촉매 활성에 요구되는 필수 아미노산이 화학적 수식에 의해 조사되었다. 이 효소들은 rose bengal 과 N-bromosuccinimide에 의해 효소활성이 완전히 저해되었다. 그러나 pH에 의한 이들 시약의 methionyl group 반응 선택성, histidine에 선택적으로 작용하는 diethyl pyrocarbonate에 대한 효소의 완전 활성 유지를 고려해 볼 때 methionyl 기나 histidyl 기가 아닌 tryptophanyl 기가 효소의 활성 부위에 관여하리라 생각된다. 결론적으로 분자량, subunit, 아미노산 비율의 분석, 촉매 활성에 필수적인 활성 부위의 수식, 트립토판 형광 스펙트라의 결과들로 부터 세 효소의 분자구조는 매우 유사하다는 것을 알 수 있었다.
이들의 최적 반응 온도와 pH는 표준 반응 조건하에서모두 62.5℃와 5.0 이었다. 산업적 이용 가능성의 지표로서 60℃ 와 65℃에서 열안정성이 조사 되었는데 놀랍게도 III형은 Novozyme 230 (Novo A/S, Denmark) 과 거의 같은 높은 열안정성 (24 시간 동안 60℃에서 원래 활성의 67%을 보여 주었고 열 안정성 정도는 III> II> I 순이었다. 만일 I, II, III 의 비율을 조절할 수 있다면 이 이눌라아제는 열 안정성 관점에서 산업적으로 이용 가능 하리라 생각한다.
세 효소들은 설탕에 대한 Km과 Vmax값에 분명한 차이를 나타냈다. 이 효소들은 β-2,1-fructosyl기로 연결된 기질에 선택적으로 작용 하였으며 turanose (α-3,1), lactulose (β-4,1), palatinose (α-6,1)와 같은 다른 결합을 가지는 기질에는 대단히 낮은 활성을 나타냈다. 또한 이들은 melezitose와 박테리아 levan 은 분해하지 못했는데 α-glucosidase의 활성이나 β-2,6- 결합 분해 능력이 없음을 보여준다. 이들은 설탕에 대한 친화력이 이눌린 보다 높은 것으로 보아 β-D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) 으로 명명 되어야할 것이다. 현재까지 A. niger M79로 부터 세가지 형태의 이눌라아제가 몇개의 유전자로 부터 기원 되는지 알 수는 없다. 그러나, 이들 효소의 생리적 의미, 분자 구조 특성, 촉매 특성을 고려해 볼 때 이 들은 isoenzymes라기보다는 non-isoenzymic multiforms (secondary isoenzymes) 으로 생각된다.
A. niger의 이눌라아제의 성질과 비교하기 위하여 박테리아인 Bacillussubtilis의 이눌라아제가 부분 정제되었다. 이 이눌라아제는 구성 효소로서 분비되었으며 분자량 49,000 의 비교적 작은 크기의 효소였다. 등전점은 5.2 였다. 이 효소는 중성에 가까운 pH6.6 에서 최대의 효소활성을 나타내었고 산에서는 쉽게 효소 활성을 잃었다. 최적 반응 온도는 50℃이었고 설탕에 대한 친화력은 18mM, raffinose에 대해서는 25mM 의 Km 값을 보였다. 이 효소는 A. niger 와 마찬가지로 fructosyl 기의 끝 부분 부터 잘라가는 exowise cleavage mode 를 보였고 이눌린 보다도 설탕에 더 높은 활성을 보이는 β-D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) 이었다.
