The bioluminescence of the bacterial system was considered to be consist of two separated steps. One is the activation of the molecular oxygen by the cofactor of the enzyme, reduced FMN, to form complex-I in which the cofactor is known to be the form of 4a-hydroperoxy FMN, and the other is the oxidation of the substrate, aliphatic aldehyde of longer chain than heptyl aldehyde, to the corresponding carboxylic acid. The complex-I is relatively stable, and can be isolated in pure form by low temperature chromatographic methods. The reaction between the isolated complex-I and long chain aliphatic aldehyde can be executed in one step reaction, in which the chemiexcitation to generate an electronically excited state and to emit bioluminescence was included. The specificity of alkyl chain of aldehyde was examined, and for the first time the acetaldehyde was found to be a substrate of the complex-I producing weak luminescence and acetic acid at relatively high concentration (Km = 7-8 mM), while other short chain aldehydes from propyl aldehyde to hexyl aldehyde were found not to be efficient substrates. The acetaldehyde-induced bioluminescence was greatly stimulated to that of regular long chain aldehyde reaction by addition of long chain alkyl compounds, aldehydes or not, and the degree of stimulation is dependent upon the chain length and the polar head group of included alkyl compounds, which are competetive inhibitors of long chain aldehydes in regular reaction. n-Octyl bromide is found to be most efficient stimulant, and the chain length of nonyl or decyl group is optimal. The production of acetic acid was also increased by long chain alkyl compounds, suggesting the specificity of chain length of aldehyde and changed reactivity of complex-I to the included formal group, either of acetaldehyde or long chain aldehyde. The binding constants of long chain alkyl compounds to the complex-I to form complex-I' were in the range of $10^5-10^7$M, which were dependent upon the character of alkyl compounds. In the absence of long chain aliphatic aldehyde, the complex-I was cleaved into apoenzyme, free FMN, and hydrogen peroxide. But in the presence of the long chain alkyl compounds, the rate of the cleavage of complex-I is slowed, that is the stability of complex-I' is much greater than that of complex-I. The exact meaning of the enzymatic production of the hydrogen peroxide is not well established, but the regular reaction of long chain aldehyde generates a delayed bioluminescence as well as fast luminescence by inclusion of hydrogen peroxide. The arise time and intensity of the delayed luminescence were dependent upon the concentration of the included hydrogen peroxide, the exact nature of the delayed luminescence was not resolved yet. The bacterial bioluminescence, regular or acetaldehyde-induced, were inhibited by free radical scavengers, such as n-propyl gallate, tribromophenol, sodium benzoate, and tri-t-butyl phenol, suggesting the involvement of free radical intermediate in the reaction sequence between complex-I and electronically excited species.
Photobacterium fischeri 등의 발광 세균의 생체 발광 반응은 긴사슬 카르복시산 환원 효소, NADH-FMN 산화 환원 효소, 박테리아 루시퍼라제, 그리고 루마진 단백질등 적어도 4 종류 이상의 단백질이 관여하는 여러 과정으로 이루어진 복잡한 반응이다.
이러한 세균의 생체 발광반응에서 화학적 여기 반응이 일어나는 과정의 성격을 규명하기 위하여 박테리아 루시퍼라제에서 환원형 flavin 과 분자 산소가 FMNH-4a-hydroperoxide 의 형태로 결합된 complex-I 을 순수 분리하여 기질인 긴사슬 알데히드와의 2 분자 반응으로 간결화하여 stopped-flow 기구를 사용하여 실험하였다. 기질인 알데히드는 카르복실기로 산화될 수 있는 포밀기와 소수성의 긴사슬로 구성되어 있는데 발광 반응에서의 이 사슬의 역할과 특히 포밀기의 반응성에 주는 영향을 고찰하였다. 이를 위하여 긴사슬 알데히드를긴사슬 부위와 포밀기로 구분하고자 하였는데 포름 알데히드는 기질로작용할 수 없으나 짧은 메칠기를 갖는 아세트 알데히드는 complex-I 의 비교적 양호한 기질로 작용하여 아세트 산으로 산회되며 동시에 490 nm의 파장에서 최대치를 갖는 정상적인 발광 현상을 보였다. 아세트 알데히드로 부터 야기되는 발광의 강도는 정상 기질인 긴사슬 알데히드의 경우보다 매우 느리고 효율 또한 낮았는데, 이로 부터 긴사슬이 단순한 기질의 부착기로서 뿐만 아니라 효율적인 발광 반응에 필수적인 요인임을알수 있었다.
또한 아세트 알데히드와 그 유도체들의 발광 가능성의 고찰로 부터 α-수소의 존재와 카르복닐기의 극성이 반응 여부를 결정하는 중요한 요인임을 알수 있었다.
긴 사슬을 갖고 있으나 알데히드가 아닌 물질들은 complex-I 에정상 기질과 유사하게 부착되어 종말 중간체를 형성함으로써 정상 기질에 대하여 경쟁적 반응 저해를 보이고 있으나 이 종말 중간체 (complex I') 은 아세트 알데히드에 대해서는 complex-I 그 자체보다 월등하게증가된 반응성을 보였다. 이러한 반응성의 증진 정도는 부착된 긴사슬 물질의 사슬의 길이와 말단기의 성격에 크게 영향받아 옥틸이나 노닐기에서 최대치를 보이고 -Br > $-COCH_3$ > -OH > $-CO_2H$ > $-CH_3$의 순서로 말단기에의 의존성을 보였다. 이러한 사실에서 긴사슬기의 역할은 단순한 부착기 외에 부착을 통한 효소 분자 구조의 변화를 야기시킴으로써 포밀기에 대한 반응성을 증진시키며 포밀기 역시 반응기 외에 부착기로서도 작용함을 알수 있었다. 또한 긴사슬 알데히드와 아세트 알데히드의 공존 상태에서는 complex-I 은 양자와 함께 반응, 매우증진된 발광현상 (synergistic stimulations)을 보였다.
$H_2O_2$의 첨가에 의한 지연 발광 현상의 발견으로 부터 이 지연 발광이 $H_2O_2$의 농도, 긴사슬 알데히드의 농도, 그리고 이 양자의 사전 혼합 시간에 영향 받음을 규명하고 이 지연 발광은 반응의 종료 결과로 형성된 효소-FMN 복합체로 부터 $H_2O_2$에 의해 형성된 complex-I에 기인함을 알수 있었고 여기서도 긴사슬기의 부착에 의한 효소 분자구조 변화가 지연 발광의 형성 여부를 결정하고 있었다.
자유기 흡수체에 의한 생체 발광 반응의 저해로 부터 자유기 중간체의 존재를 확인했으며 이 중간체는 유기 peroxide의 형태를 갖고 있는 고 에너지 함유 중간체로 부터 형성됨을 알수 있었다. 또한 dioxetane에서 알려진 "red light to blue light" 현상과 아세트 알데히드발광과 긴사슬 알데히드의 발광간의 활동화 에너지 차이로 부터 이 dioxetane 중간체를 거치는 생체 발광 반응의 기작을 제시하였다.
