The influence of culture conditions on the growth of $\underline{Lactobacillus}$ $\underline{bulgaricus}$ NLS-4 was studied. The organism was cultured continuously in a chemostat with media having limited amount of glucose by which the growth was regulated. When each culture reached steady state, the culture broth was sampled and analyzed for biomass, metabolites and residual substrate as well as microscopical observation of the cell morphology. These continuous cultures were originally designed using growth parameters obtained simply through batch cultures.
The specific growth rate which was represented by the dilution rate in the steady-state continuous culture was found to have a close relationship with the fermentation balance of this organism. Under the glucose-limited continuous culture, the $\underline{L}$. $\underline{bulgaricus}$cells which have long been known as homofermentative lactic acid bacteria showed their typical character only when they grew at the growth rates higher than 0.45 $hr^{-1}$. When they grew slower than this, considerable amounts of formate, acetate and ethanol appeared in the culture solution besides the lactate indicating a heterofermentative nature. The values of $Y_{ATP}$, which is the growth yield per ATP molecule, also varied within the range of 13.3 to 23.5 g cell/mole ATP depending upon the specific growth rate. These values are significantly higher than the average $Y_{ATP}$ value of 10.5 which has been widely recognized since the discovery by Bauchop $\&$ Elsden. The difference may be due to the less need of maintenance energy under the present culture conditions.
The level of dissolved oxygen in the culture medium affected on the fermenatation balance, maintenance energy, yield coefficient based on glucose ($Y_{glc}$) and the internal enzyme system. The homofermentative character of $\underline{L.}$ $\underline{bulgaricus}$ NLS-4 was maintained when the dissolved oxygen tension was as low as 15.6 mmHG. Above this level, the production of acetate increased and under the complete aerobic condition (120 mmHG), acetate turned to be the main product of the glucose fermentation. Under the last case, both formate and ethanol could not be detected in the culture solution. With the increase of the dissolved oxygen tension, the $Y_{ATP}$ values also increased, meanwhile the total growth decreased due to the toxic effect of excess oxygen. Among the respiratory enzymes, NADH-oxidase, catalase and superoxide dismultase could not be detected while some NADH-peroxidase activity was detected. The complete absence of cytochrome system was confirmed and lactate dehydrogenase was inhibited in some degree by oxygen.
The pH of culture medium also gave distinct effects on both fermentation balance and morphology of $\underline{L.}$ ${\underline{bugaricus}$ NLS-4. The homofermentative character of this strain was found to be altered to heterofermentative type with the change of medium pH from acidic to alkaline region. The organism synthesized lactate dehydrogenase (LDH) better under acidic pH than in alkaline medium. The LDH from this organism did not require fructose-1, 6-diphosphate or manganese ions for catalytic activity. Involvement of the phosphoroclastic split in the pyruvate conversion under alkaline environment was also confirmed. The high LDH synthesis in acidic medium together with the participation of phosphoroclastic split under alkaline condition made an explanation on the shift from homolactic to heterolactic fermentation of $\underline{L.}$ $\underline{bulgaricus}$ NLS-4 with the change of environmental pH possible. The cell chains increased their length with the increase of pH values yielding changes of folded filaments at pH above 8.0. The involvement of lytic enzyme(s) in the separation of cells was confirmed and the poor synthesis of this enzyme(s) under alkaline cultural conditions could explain the pH-related filamentous growth of this organism.
The involvement of enzyme synthesis on the separation of filamentous cells was also confirmed by the observation of long chains in the culture grown under temperatures which were considered to be unfavorable for the synthesis of the lytic enzyme(s). Throughout the temperature ranges tested at low dilution rate (d = 0.07 $hr^{-1}$), $\underline{L.}$ $\underline{bulgaricus}$ cells showed a heterofermentative pattern only indicating a synergistic effect between the environmental factors the glucose metabolism of $\underline{L.}$ $\underline{bulgaricus}$ NLS-4.
미생물 농도를 증가시키기 위한 선결 문제로서 배양환경에 따른 $\underline{Lactobacillus}$ $\underline{bulgaricus}$ NLS-4의 반응에 관하여 chemostat 을 이용한 연속 배양법으로 체계적인 연구를 행하였다. 미생물의 증식반응에 영향을 미치는 환경인자 중 증식률, 용존산소압, pH 및 온도를 선정하여 각 인자의 변화에 대한 $\underline{L}$. $\underline{bulgaricus}$ NLS-4 의 반응을 조사한 결과 생장, 생리 및 형태적으로 현저한 변화가 나타남을 알 수 있었다.
회분 배양에서 얻어진 growth parameter와 Monod의 식으로 부터 추정된 결과와 연속 배양에서 얻어진 실험 결과는 저 희석률과 고 희석률 에서는 일치하지 않았다.
Glucose를 제한 기질로 한 연속 배양의 경우 미생물의 증식률에 관계없이 lactate 가 주생성물 이었으나 증식률이 낮을 경우 formate, acetate 및 ethanol 의 생성이 증가 하였고 증식률이 $D = 0.45 hr^{-1}$ 이상의 경우에만 homofermenter 로서의 특성을 보여주었다. 생체 에너지 적인 측면에서의 ATP 에 대한 증식효율 ($Y_{ATP}$)은 증식률에 따라 13.3 -23.5 g cell/mole ATP 로서 Bauchop 및 Elsden 이후 정설화된 상수 값 10.5 보다 높은 값을 보여 주었는데 이는 주어진 환경 조건에서는 소량의 maintenance energy 만이 필요하기 때문에 나타난 결과로 추정되었다.
용존산소의 경우 산소압이 15.6 mmHg 이하 일때만 homofermenter 로서의 특성을 보여 주었고 산소압의 증가에 따라 acetate의 생성이 증가하여 호기적인 조건하 에서는 acetate 가 주 생성물 이었다. 이 경우 formate 와 ethanol 은 거의 생성되지 않았다.
호흡률의 경우 용존 산소압 10 mmHg 이상에서는 영항을 받지 않았고 maintenance 에 이용되는 산소 및 energy의 양도 많지 않았다. 용존 산소압이 증가함에 따라 $Y_{glc}$ 값은 증가하였으나 실제 증식량은 감소하였으며 이는 산소에 의한 증식 저해의 결과로 판명되었다. 호흡대사에 관여하는 효소중 NADH-oxidase, catalase 및 superoxide dismutase 는 측정되지 않았으나 NADH-peroxidase 는 낮은 역가를 보여 주었다. Cytochrome 은 존재하지 않음이 확인되었고 산소에 대한 lactate dehydrogenase 의 저해를 알 수 있었다.
pH 의 경우 6.5 이하에서만 homofermentation 이 일어났고 그 이상에서는 전형적인heterofermentation 이 일어났다. 이는 alkali 성 환경하 에서는 lactate dehydrogenase 의 생성이 저해받기 때문인 것으로 확인되었고 fructose-1,6-diphosphate 에 의한 lactate dehydrogenase 의 활성화는 나타나지 않았다. 실험 조건에서의 $Y_{ATP}$ 값은 평균 18,5 로서 역시 소량의 maintenance energy 에 기인한 것으로 추정되었다. pH 변화에 따른$\underline{L}$. $\underline{bulgaricus}$ NLS-4 의 현저한 형태적인 변화가 관찰되었다. Alkali 성 환경조건 하에서는 chain 이 끊어지지 않고 clump 가 생성 되었으며 이러한 형태적인 변화에는 자기 소화 효소가 관여하고 있음이 확인되었다. Chain 의 길이에 따라 colony 의 형태도 바뀜이 관찰 되었으나 자세한 mechanism 은 밝혀지지 않았다.
온도 변화에 따라서도 발효형태가 바뀌어 주어진 조건 하에서는 heterofermentation 만이 일어났으며 다른 환경 인자와의 상승 효과를 보여 주었다. 최적온도 범위를 벗어나면 energy 생성과 관련되지 않은 저효율의 증식 양상이 확인되었고 온도 변화에 따라서도 chain 길이에 변화가 나타나 이 반응에 대한 효소 관여 사실을 뒷받침해 주었다.
