This investigation has the overall aim of elucidating the basic mechanism of membrane fusion using model systems. It involves two related but independent investigations. In the first part of the investigation, it was found that protein 4.1 from human erythrocyte membrane induces the fusion of phophatidylserine(PS)/phosphatidylethanolamine(PE) vesicles under acidic condition and causes the leakage of the vesicles at a broad pH range. The pH-dependent binding of protein 4.1 to phospholipid vesicles was similar, but not identical to the pH-dependent fusion. Proteolytic digestion of vesicle-protein 4.1 complex with trypsin showed that segments of protein 4.1 with molecular weight of approximately 26,000 and 33,000, respectively, are protected from the proteolysis. Protection of the vesicles from the attack of phospholipase D in the presence of protein 4.1 at neutral pH showed that protein 4.1 makes a close contact with the surface of vesicles. It does not, however, bind irreversibly to the vesicles at the pH.
In the second phase of this investigation, fusion of phosphlipid vesicles compoesd of various combination of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and phosphatidic acid was induced by $Ca^{2+}$ with of without the presence of phospholipase D at neutral pH. For the vesicles composed of 20:50:30 molar ratio of phosphatidylcholine/phosphatidylethanolamine/phosphatidic acid, the initial fusion rate was much faster than the expected value when only the conversion of phosphatidycholine and phosphatidylethanolamine into phosphatidic acid by phospholipase D is taken into account. Inhibition of phospholipase D activity also drastically reduced the extent of fusion to the level of $Ca^{2+}$-induced fusion. These observations are discussed in terms of the involvement of outer monolayer of the vesicles and the enzyme activity itself in the fusion process.
본연구는 두개의 독립된 모델시스템을 이용하여 막융합의 기전을 밝히려는 목적으로 수행되었다. 첫째, 사람의 적혈구에서 정제된 4.1 단백질은 산성조건에서 PS/PE 인지질막을 융합하는 것을 발견하였다. pH 에따라 4.1 단백질이 막에 결합하는 것은 막의 융합이 일어나는 정도와 완전히 일치하지는 않지만 비슷하였다. 막-4.1 단백질 복합체를 trypsin으로 가수분해하여 보면 산성조건에서는 분자량 26,000 과 33,000 정도의 단편이 보호되었다. 중성조건에서 4.1 단백질이 존재하면 막의 인지질들이 phospholipase D에의한 가수분해로 부터 보호되었다. 이것은 4.1 단백질은 중성 pH 에서 막의 표면에 가역적으로 결합하지만, 산성 pH 에서는 비가역적으로 결합하여 막의 융합을 유도하는 것을 나타내준다.
둘째, $Ca^{2+}$ 에의해 융합이 일어나는 PC/PE/PA (20:50:30) 에대한 phospholipase D 의 영향을 살펴보았다. 양배추와 박테리아로 부터 분리된 Phospholipase D는 $Ca^{2+}$과 함께 막의 융합, 막의 누출, 인지질 분자의 막통과등을 촉진하였다. Phospholipase D에의해 유도되는 막의 융합은 일부 phospholipase D 에의해 PA가 생성되어 일어나지만, PA 생성에 의한 융합의 촉진 정도보다 훨씬 빨랐다. 또한 Phospholipase D 의 활성을 저해제로 저해하였을 때 막융합이 촉진되지 않았다. 이로 미루어 phospholipase D 의 효소활성이 PA를 비대칭적으로 막의 바깥층 분포하도록 하여 막의 구조를 변화시켜 막의 융합을 촉진할 것이라 생각하였다.
두 시스템에서 막의 융합은 단백질에의해서, 또 인지질 막 자체의 구조변화등에 의해서 유도됨을 알 수 있었다.