An alkaline-resistant bacterial strain (gram-negative), which exhibited protease activity at alkaline condition (pH 11), was isolated. A gene (aprJ) responsible for the alkaline protease activity of the bacterial strain was cloned into Escherichia coli JM83 and expressed. DNA sequencing found an open reading frame of 1,266 nucleorides which could potentially encode a precursor of the alkaline protease (AprJ) comprised 422 amino acids. The N-terminus of the open reading frame had a putative signal sequence. The C-terminal portion (283 residues), which probably corresponded to the mature form of the AprJ, showed high sequence homology (31-46%) with the subtilisin-type serine proteases. Extremely high sequence identity was observed in the regions containing the active-site residues, $Asp^{169}$, $His^{202}$, and $Ser^{358}$. The synthesis of AprJ in E. coli was started in the stationary phase of growth and the produced AprJ was released to the extracellular medium immediately without any detectable intracellular accumulation. The AprJ was most active around pH 12.0 and stable in the pH range of 6-11. $Ca^{2+}$ stablized AprJ to heat treatment. The maximum activity was observed at 60℃ and its stability was maintained below 55℃ in the presence of 1mM $CaCl_2$. AprJ was completely inactivated by 1mM PMSF, an inhibitor of serine enzyme. The results of the homology analysis for the predicted amino acid sequence and the study for the effect of inhibitor (PMSF) suggest that AprJ is a subtilisin-type serine protease (EC 3.4.21.14).
알칼리 조건(pH 11)에서 단백질 분해효소 활성을 보이는 알칼리내성 박테리아 균주를 분리하였다. 그 균주로부터 알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 대장균(Escherichia coli JM83) 안으로 클로닝하고 발현시켰다. DNA 염기서열 분석 결과, 1,266개의 염기로 된 open reading frame(ORF)을 찾았다. 이 ORF는 422개의 아미노산으로 된 알칼리성 단백질 분해효소(AprJ)의 전구체를 code 할 수 있다. ORF의 N-말단에는 signal sequence와 유사한 아미노산 서열이 존재하였다. AprJ의 mature form에 해당될 것으로 생각되는, 283개의 잔기들로 된 C-말단 부분은 서브틸리신 (subtilisin) type의 serine 계열 단백질 분해효소들과 높은 아미노산 서열 유사성(31-46%)을 보였다. 특히, 활성부위를 이루는 잔기들 ($Asp^{169}$, $His^{202}$, 그리고 $Ser^{358}$) 주위에서 매우 높은 유사성이 보였다. 대장균 내에서, AprJ의 합성은 성장의 stationary phase에서 시작되었고, 합성된 AprJ는 세포 내에 축적되지 않고 즉시 세포 밖으로 방출되었다. AprJ는 pH 12 부근에서 가장 활성이 높았으며, pH 6부터 11 사이에서 안정하였다. $Ca^{2+}$는 AprJ의 열에 대한 안정성을 증가시켰다. 1mM의 $CaCl_2$가 존재할 때, 60℃에서 최고 활성이 관찰되었고 55℃ 이하에서 안정성이 유지되었다. AprJ는 serine 계열 효소의 활성 저해제인 PMSF 1mM에 의해 완전히 활성이 저해되었다. DNA 염기서열로부터 추측된 아미노산 서열에 대한 유사성 분석과 활성 저해제(PMSF)의 영향에 대한 연구의 결과들은 AprJ가 서브틸리신 (subtilisin) type의 serine 계열 단백질 분해효소임을 제안한다.