Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO), which is a common solvent to dissolve test compounds in mutagenesis and drug metabolism studies, on drug metabolism were investigated by using the primary culture of adult rat hepatocytes and the microsome isolated from rats. Addition of DMSO to the hepatocyte culture induced the P-450IIEl-specific aniline hydroxylase activity and the P-450IAl-specific ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) activity dose- and time-dependently from 0,1%(v/v) concentration. The P-450IIB-specific pentoxyresorufin O-dealkylase activity was also induced at 2%(v/v) concentration. To investigate the mechanism of inductiuon of EROD activity by DMSO, Northern and dot blot analyses were performed by using an oligonucleotide probe, but no increase of P-450IAl mRNA was found. When 1.0 μM cycloheximide was treated to the hepatocyte culture, the induction of EROD activity by DMSO was disappeared, indicating that the induction was not mediated by the accumulation of P-450IAl mRNA, but by the increase of P-450IAl protein syntheses. In fact, the increase of P-450IAl protein by DMSO was observed in microsomes isolated from the hepatocytes cultured with 2% DMSO by using the ELISA and Western immunoblotting.
On the other hand, when DMSO was added into the reaction mixtures for isozyme-specific monooxygenase reactions, the P-450IIEl-specific p-nitrophenol hydroxylase (PNPH) activity was inhibited profoundly and dose-dependently from 5 mM concentration. Other monooxygenations were not affected at this concentraion. Demethylation of DMSO by itself was observed. The inhibition of PNPH by DMSO was not related to NADPH P-450 reductase, but was a competitive inhibition with Ki value of 12.7 mM in microsomes from female rats and a weak mixed competitive-noncompetitive inhibition with Ki value of 32.3 mM in microsomes from male rats. Therefore, precautions should be taken if DMSO is a solvent to study drug metabolism and mutagenesis of chemicals, and DMSO can be useful as a specific inhibitor or the P-450IIEl-mediated reactions.
To optimize the mixed culture of murine hepatocytes and splenocytes for assessing the immunotoxicity, the importance of hepatocyte culture conditions in dimethylnitrosamine (DMN)-induced suppression of antibody response was studied. DMN was activated well to its immunosuppressive form(s) when splenocytes were cocultured with the hepatocytes cultured for 24 hr in the hormone-supplemented AB medium, whereas the activation of cyclophosphamide (CTX) to its immunosuppressive form was not affected by the hepatocyte culture conditions. This different activation of DMN might not be resulted from the Phase I and Phase II activities of hepatocytes cultured in basal and complete media. Among the constituents in the hormonal AB medium, hydrocortisone was essential to activate DMN to its immunosuppressive form(s). The role of hydrocortisone in DMN-induced immunosuppression was confirmed by serial experiments. Other potent glucocorticoid dexamethasone also affected the DMN activation, but the role of hydrocortisone and dexamethasone in DMN activation was not related to the glucocorticoid receptor, because RU 38486 could not reverse the DMN-induced immunosuppression when it was treated to the hepatocyte culture medium. Although hydrocortisone and dexamethasone suppressed the antibody response by themselves, their direct effect on the antibody response could be excluded by many evidences in the coculture. Role of P-450s in the activation of DMN and CTX should not be excluded, because pargyline, an inhibitor of DMN demethylase, could reverse both DMN- and CTX-induced suppressions of antibody response. The mixed culture of murine hepatocytes and splenocytes could be useful to assess immunotoxicities of many chemicals requiring metabolic activation and to study the mechanism of their immunotoxicities.
본 연구에서는 발암성 실험 및 약물대사 연구시 용매로써 흔히 사용되고 있는 dimethyl sulfoxide (DMSO) 자체가 약물대사에 어떤 영향을 미치는 가를 rat의 일차배양간세포와 간 microsome분획을 이용하여 알아 보았다. 먼저 DMSO를 일차배양 간세포에 처리할 때 0.1%(v/v) 에서 2.0%(v/v)의 농도까지 용량에 비례하여 P-450IIE1에 특이적인 aniline 4-hydroxylase의 활성도 및 P-450IA1에 특이적인 ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) 활성도가 현저하게 유도 (induction) 됨을 알아내었고 2%(v/v)의 고농도에서는 P-450IIB1에 특이적인 pentoxyresorufin O-dealkylase의 활성도도 유도됨을 밝혔다. 특히 P-450IA1 특이 반응인 EROD 활성도의 유도 기작을 밝히기 위하여 Northern 및 dot blot 실험을 수행한 결과 P-450IA1 mRNA의 변화가 없었으며, 단백질 합성 저해제인 cycloheximide를 간세포 배양액에 처리하였을 때 DMSO에 의한 EROD 활성도의 유도현상이 억제되는 것으로 보아 DMSO에 의한 일차배양 간세포의 P-450IA1 유도현상은 단백질 합성 과정에 영향을 주어 나타난 결과로 해석되었다. 실제 ELISA 및 Western immunoblotting 실험을 통하여 DMSO 처리시 일차배양 간세포의 P-450IA1 단백질의 양이 증가됨을 확인할 수 있었다.
한편 간 microsome 분획을 사용하여 몇가지 P-450에 특이적인 반응들에 대한 DMSO의 영향을 살펴 본 결과, P-450IIE1에 특이적인 p-nitrophenol hydroxylase (PNPH)의 활성도가 5.0 mM의 낮은 농도에서도 매우 특이적으로 억제되는 결과를 얻었고 다른 효소 활성도들은 영향이 적거나 없었다. 이러한 저해현상은 유도제를 처리하여 특정 단백질을 증가시킨 microsome 분획을 이용한 실험에서도 확인할 수 있었다. 또한 DMSO 자체가 NADPH 생성계를 첨가해 준 microsome 분획 내에서 탈메칠화가 일어남을 알아 내었으며, DMSO에 의한 PNPH의 억제현상은 P-450에 전자를 전달해 주는 것으로 알려진 NADPH P-450 reductase와는 무관한 P-450 단백질 자체와의 상호 작용에 의한 것으로 사료되었다. DMSO에 의한 PNPH 활성도의 저해는 암컷 rat에서 분리한 microsome에서는 상경적 저해 (competitive inhibition) 양상을 보였으며 숫컷 rat에서 분리한 microsome에서는 약하긴 하나 혼합형의 상경적-비상경적 (competitve-noncompetitive) 저해 양식을 보였다. 따라서 DMSO 자체가 약물대사에 많은 영향을 주는 것으로 보아 약물대사 연구 및 돌연변이원성 실험 시 DMSO를 용매로 사용할 경우 세심한 주의가 요구되는 것으로 사료되었으며, DMSO를 P-450IIE1 특이 반응의 연구 시 특이적인 저해제로 사용할 수 있는 가능성을 제시해 주었다.
또한 본 연구에서는 일차배양 간세포를 화학물질의 면역독성 검출에 사용할 목적으로 간세포와 비장세포의 공동배양 시스템을 개발 및 최적화하고자 하였다. Dimethylnitrosamine (DMN)과 cyclophosphamide (CTX) 의 면역독성을 본 연구실에서 개발 한 간세포-비장세포 공동배양에서 검출할 때 간세포 배양조건에 따른 영향을 살펴 본 결과, DMN은 홀몬이 없는 WO/BA-$M_2$ 배지에서 보다 홀몬이 첨가된 AB 배지에서 간세포를 배양할 시에 면양 적혈구에 대한 비장세포의 항체반응을 잘 억제한 반면, CTX의 경우에는 간세포 배양조건에 관계없이 항체반응을 억제하였다. 이러한 간세포 배양 조건에 따른 DMN의 면역억제 차이가 일차배양 간세포의 약물대사능의 차이에 의한 것인 가를 알아보기 위하여 각기 다른 조건에서 간세포를 24 시간 동안 배양한 후 약물대사능을 조사한 결과 뚜렸한 차이를 발견할 수 없어 DMN의 면역억제는 기존의 P-450에 의한 활성화 외에 홀몬에 특이적인 다른 대사 경로가 존재할 수 있음을 제시해 주었다. 한편 AB 배지의 특정 성분을 제거 해 준 배지로 간세포를 배양한 후 비장세포와의 공동배양에 이용한 결과 배지성분 중 hydrocortisone이 DMN의 면역독성 유발에 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 간세 포 배양 시 dexamethasone을 첨가해 주어도 DMN의 면역억제를 검출할 수 있었으나 glucocorticoid 수용체에 대한 길항제인 RU 38486을 간세포 배양에 처리하여도 DMN의 면역 독성이 사라지지 않는 것으로 보아 hydrocortisone과 dexamethasone의 역할은 그들의 수용체를 통한 것은 아닌 것으로 판단되었다. 그리고 hydrocortisone 과 dexamethasone 자체가 면역억제능이 있지만 공동배양에서 이들이 면역억제를 일으키지는 않는 것으로 판단되었다. 본 연구 결과, 화학물질의 면역독성 판정시 간세포-비장세포 공동배양 시스템을 사용하면 면역 억제 현상을 외부에서 조절할 수 있으므로 여러가지 면에서 유용하리라 기대된다.
